精子表面透明帶蛋白受體的分析與功能研究

李秋華，周澤榮，祝曉麗，譚 穎，鐘小英，姜榮華，宋 革

(廣東省計劃生育科學技術研究所生殖中心，國家衛生計生委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 廣州 510600)

在多數育齡夫婦中，約15%的夫婦出現不孕不育。基于此，如何有效治療不孕不育也是醫學領域研究的熱點問題，而實施體外受精(in vitro fertilization，IVF)是臨床最常使用的治療方法之一。精子透明帶結合障礙是導致IVF受精率低的關鍵因素[1]，Meta文獻分析表明，其能力對受精結局有較高的預測價值[2]。大約13%的精液參數正常的男性出現透明帶結合障礙，而這一數值在少精癥與畸精癥男性中分別為56%和68%[3]。可利用透明帶結合試驗明確是否發生透明帶結合障礙，但是由于人廢卵來源有限，限制了其在臨床上的應用，確定精子透明帶結合能力和受精能力具有臨床意義[4]。本研究擬對精子細胞膜表面SLEX/透明帶(zona pellucida，ZP)結合蛋白展開定量研究，明確精子透明帶結合及其受精能力，為輔助生殖中診斷精子-透明帶結合缺陷的快速穩定方法，更有利于闡述精子及其透明帶結合能力在輔助生殖中的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年1月至2018年12月本院生殖中心的就診者，年齡22～50歲，共76例精液標本(23例正常生育者，53例不育患者)。正常生育組納入標準：均為健康成年男性，已有生育史，其精液常規各項檢測指標正常(按照WHO第五版精液常規參數)，精漿及血清抗精子抗體陰性。不育組納入標準：均為婚后1年以上不育(女方不孕因素已排除)，采用常規IVF治療過程中女方獲卵數大于5枚，受精率低于30%或者受精完全失敗患者的精液標本。無既往相關病史，生殖器及其附屬性腺體檢未見異常。兩組年齡比較差異無統計學意義(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1試劑 精子細胞BWW培養液 (Toscience公司)；Percoll分離液(由美國的Pharmacia公司提供)；熒光標記SLEX-牛血清蛋白(Invitrogen)；一抗鼠抗人C1orf56，ZPBP1，SPACA1單克隆抗體(Abcam)；絡合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITG-PSA)熒光標記試劑盒(生產廠家：安徽安科生物工程股份有限公司)。

1.2.2精子標本制備及分析與透明帶結合 所有供精人員需要禁欲時間控制為5～7天，通過手淫方法取精液于無菌塑料杯中，待其完全液化后，利用精子分析儀開展常規的檢查，包含精子濃度、形態等指標。采用半透明帶試驗(hemizona assay，HZA)分析不育組是否存在透明帶結合障礙，選取正常生育組男性的精子作為對照組。卵子來源于ICSI過程中未受精卵，之前患者簽署知情同意書。HZA結果用半透明帶精子結合試驗指數(HZI)表示，計算公式為不育組精子結合數/對照組精子結合數×100，HZI=30作為判斷是否存在結合障礙的臨界值，當HZI<30，認為存在障礙。

1.2.3精子自發頂體反應率檢測 采用絡合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITG-PSA)熒光標記法頂體染色。取優化處理后的精子懸浮液5 μl涂片2張，自然干燥后以95%乙醇固定30 min。加入60～100 μl FITG-PSA工作液，4 ℃下反應2～17 h；用純水沖片，1000倍油鏡下觀察，計數精子，并計算自發頂體反應率=頂體反應數/(頂體反應數+AI)×100%，AI為頂體完整的精子。

1.2.4精子膜表面SLEX結合蛋白的測定 采用流式細胞儀檢測精子C1orf56，ZPBP1，SPACA1的免疫反應性以及與熒光標記的 SLEX-牛血清蛋白(SLEX-BSA，一種新生糖蛋白)的結合能力。取透明帶結合障礙組精子加1 ml PBS洗滌并800 rpm離心收集細胞。按照抗體比例加入一抗，置于室溫孵育1～2小時，1500 rpm離心5 min，去上清，加入PBS重懸細胞，重復3次，置于0.1 ml PBS中。加入熒光二抗，室溫孵育1小時。500 rpm離心5 min，去上清，加入PBS重懸細胞，重復3次，最后置于0.2 ml PBS中，上機檢測。

1.2.5Western Blot 檢測精子膜蛋白中C1orf56，ZPBP1，SPACA1蛋白的表達水平 取透明帶結合障礙組精子加l ml 4 ℃預冷的PBS洗滌并800 rpm離心收集細胞，加入細胞裂解液，充分作用后放置冰上；4 ℃條件下10分鐘13 000 rpm離心后可見分為兩相的溶液，蛋白膜位于兩相之間，去除上層相和下層相，保留中間蛋白沉淀，-80 ℃凍存。通過蛋白免疫印跡法(Western blot)對C1orf56、SPACA1等指標進行檢測。采用凝膠成像儀完成條帶掃描，根據其與內參β-actin、GAPDH吸光度值之間的比值顯示相對含量數值。

1.3 統計學方法應用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不育組透明帶結合障礙的結果半透明帶試驗(HZA)中對照組采用23例正常生育的健康成年男性，不育組53例中采用常規IVF治療過程中受精率小于30%或者受精完全失敗患者的精液標本進行，分析不育組是否存在結合障礙，結果表明32例患者HZI<30，有60.4%的比例，認為出現透明帶結合障礙。

2.2 精子自發頂體反應率檢測結果熒光標記法頂體染色中，不育組透明帶結合障礙患者的精子自發頂體反應率(25.05±6.45)% 顯著高于對照組(5.12±2.12)%，差異有統計學意義(t=14.244，P< 0.001)；在不育組中，透明帶結合障礙患者的精子自發頂體反應率(25.05±6.45)% 明顯高于無透明帶結合障礙組(15.32±4.76)%，差異有統計學意義(t=5.927，P< 0.001)。

2.3 精子膜表面SLEX結合蛋白的測定在精子膜表面SLEX結合蛋白中，不育組結合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1以及與熒光標記的 SLEX-牛血清蛋白的結合明顯減少，差異有統計學意義(P< 0.05)。見表1。

表1 兩組精子膜表面SLEX結合蛋白的測定比較

2.4 精子膜蛋白中各蛋白水平的表達精子膜蛋白中，不育組結合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP及其SPACA1蛋白表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P< 0.05)。見表2。

表2 精子膜蛋白中C1orf56、ZPBP1、SPACA1蛋白的表達水平比較

3 討論

在輔助生殖治療的過程中患者行常規IVF或者ICSI的選擇依據主要是精液常規分析結果，但精液常規分析不能提供關于精子功能如精子-透明帶結合能力的相關信息[5～7]。這些夫婦由于其男方精液常規分析結果正常，在第一次輔助生殖治療中，患者往往選擇常規IVF而非ICSI。在精子-透明帶結合異常的情況下存在受精率低甚至受精完全失敗的風險，給患者雙方帶來了經濟上與情感上難以彌補的傷害[8]。

為了改善這一類患者的治療結局，希望利用可靠的檢測方法診斷出存在結合障礙的精子，能降低受精失敗的風險，改善臨床結局。受精的第一步始于獲能精子與透明帶的結合，然后與透明帶結合的精子發生頂體反應[9]。精子與透明帶的結合始于精子膜表面的透明結合蛋白與透明帶蛋白分子上的糖鏈結構發生結合[10]。近20年來，對于透明帶糖蛋白上的多糖基分子研究較多，先前研究者采用超敏質譜分析法，確定SLEX是人透明帶蛋白糖基上含量最多的糖鏈序列，同時還發現SLEX表位是精卵結合過程中透明帶蛋白分子上主要的多糖性配體[11]。

部分精液參數正常的男性存在透明帶結合障礙，進而導致不育[3]。本研究發現以23例正常生育的健康成年男性為對照組，對不育組采用常規IVF治療過程中受精率低或者受精完全失敗患者的精液標本進行HZA檢測，分析不育組是否存在透明帶結合障礙，結果表明32例患者HZI<30，有60.4%的比例，說明在IVF治療中，受精率低與結合障礙相關。有研究[14]表明隨 自 發 頂 體 反 應 率 的 增 加，受 精 率 和優胚率呈降低的趨勢。而造成這種后果的機制尚不明確。目前，對參與精子透明帶結合過程中的精子膜表面蛋白了解甚少，分子機制的尚不明確。在不育男性患者中，存在精子蛋白表達的異常[15]，但尚不明確其與透明帶結合障礙之間的關系。本研究發現在精子膜表面SLEX結合蛋白中，不育組透明帶結合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1以及與熒光標記的 SLEX-牛血清蛋白的結合比例均降低；在精子膜蛋白中，不育組透明帶結合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1蛋白表達水平均降低，推測，這些變化可能通過提高精子自發頂體反應率來影響精子和透明帶結合。

綜上，本研究通過對精子表面SLEX/透明帶結合蛋白的定量分析，探索精子與透明帶結合機理。改善這一部分患者的臨床診斷與治療，在行輔助生殖治療前，采用可靠的檢測手段，精子自發頂體反應率高和(或)SLEX/透明帶結合蛋白表達的降低對于預測受精情況有一定的價值對于提高輔助生殖技術的成功率有重要意義。