在藥物分析中采取固相表面熒光光譜法的研究

趙森銘

(洛陽市食品藥品檢驗所,河南 洛陽 471008)

最早固相表面熒光分析技術是在三硝基甲苯的定量分析中得到應用，隨著研究的逐漸深入，這一方法逐漸在其他領域比如生物大分子、氣體檢測、有機污染物分析、藥物分析、無機離子分析等得到廣泛應用[1]。因為是直接于固體基質表面開展固相表面熒光的分析檢測,所以利用固相載體就能夠直接聯合其他分離技術,因此能夠完成富集目標組分、復雜樣品基體的分離，這樣可以使測定獲得更高的靈敏度，確保能夠實現分析檢測痕量、微量組分[2]。近些年研究逐漸發現固相表面熒光分析法能夠提供痕量藥物及其殘留檢測的定量信息，其具體可以應用的檢測方法包括流動系統基礎上的在線固相表面熒光分析、直接固相表面熒光分析法、聯合應用固相萃取分離富集與固相表面熒光分析，本文具體進行分析。

1 在線固相表面熒光分析法

1.1 流動注射－固相表面熒光法 研究選擇KCL溶液當作載流以及固相基質材料的再生試劑,完成了單一流路流動注射－固相表面熒光奎尼丁、奎寧分析法的建立。控制進樣為40μl，能夠準確定量分析10～650μg/L 的奎寧,進樣頻率為 33/h,10～500 μg/L的奎尼丁,進樣頻率為40/h[3]。

如果是非熒光性藥物分子,通過熒光衍生法對固相表面熒光實施分析檢測，通常情況下，流動注射進樣分析更有利于在線衍生操作的順利開展。于流動注射－固相表面熒光分析系統中引入進光反應器，通過紫外光對維生素B1實施照射，促使其在線完成向具備強熒光性的光化學產物的轉化,得到的產物可以在流通池內填充的C18硅膠上吸附保留,所以能夠完成固相表面熒光檢測維生素B1[4]。根據其完成的分析方法對目標分析物的選擇性非常強，能夠在共同具備其他維生素B復合物的基礎上快速測定維生素B1。

1.2 聯合應用固相表面熒光法 聯合應用固相表面熒光法可更新表面技術,假設將固相表面熒光檢測、流動注射方法聯合起來使用，或者將固相表面熒光檢測法、順序注射方法聯合起來使用,這樣即便流通池中填充的固相基質可以進行循環再利用,但實際上大多數情況下進行很多次次吸附操作后，或者多次洗脫操作后，固相基質表面會出現污染表現,甚至會出現有效功能團以及活性位點損失的情況,因而會使得載體表面吸附性能出現變化，洗脫性能也會出現變化,分析性能會由此下降[5]。而通過更新表面技術,這一問題得到了有效解決,這一技術是在每次分析結束后在廢液中排入使用過的固相基質材料,下一次進行分析時,反應器填充新的固相基質材料,這樣僅僅需要更新固相基質填充材料就能夠保證較高可靠性，確保檢測的精密度以及準確度[6]。

1.3 順序注射－固相表面熒光法 蠕動泵可以選擇注射泵代替，完成液流輸送，同時因為液流雙向驅動模式能夠程序化控制，所以設計流路更為簡單，也能更加靈活。在具體應用中，建議在不同模式的液流操控中選擇某一個固定的流路裝置,這樣能夠同時檢測不同組分。僅僅需要在適當時候將精確控制的樣品區帶、試劑引入后進行測定和分析，連續載流無需試劑的使用。因而該法針對長時間連續檢測更為適用,同時能夠顯著降低樣品消耗量以及試劑消耗量[7]。固相表面熒光檢測的基質材料選擇C18鍵合硅膠,固相表面化學發光檢測載體選擇Sephadex QAE A-25樹脂，在不同檢測流通池中相應導入維生素B2、B6、C的樣品溶液,能夠完成分離不同種維生素組分,固相熒光/化學發光組在線合檢測,三者的檢出限相應是0.12mg/L、0.008mg/L、9.10mg/L。

表1 藥物分析中在線固相表面熒光分析法的分析性能

2 直接固相表面熒光法

這一方法具體是在固體基質上點加藥物樣品溶液，等到其完全干燥之后，直接于熒光儀上對固相基質表面殘留的目標組分的熒光光譜給予測定，實施定性、定量分析[8]。固相表面熒光的基質材料有多種選擇，包括聚氯乙烯顆粒、硅膠、纖維素、氧化鋁、濾紙等[9]。這一方法最大的特點在于需要用到的樣品量少，操作難度小，能夠明顯減少分析所需花費,對于快速篩查或檢測大批量樣品非常適用。研究顯示，處于醋酸鈉、C18硅膠、硅膠、纖維素表面時，卡巴咪嗪不會有熒光表現，如果處于尼龍膜表面，則會有強熒光發射，主要是由于其具備一樣的胺基基團[10]。根據這一表現進行固相表面熒光分析法的建立能夠分析測定藥物制劑中、血清樣品中微量卡巴咪嗪，僅需要消耗7μl樣品量。

3 聯用固相萃取分離富集、固相表面熒光法

以往固相萃取具體是洗脫后進一步開展定性或定量分析,但是其容易出現固相基質表面目標藥物無法完全洗脫的問題，影響結果準確性，另外引入大量洗脫劑會降解藥物組分,同時洗脫劑導致的溶劑效應會改變藥物分子結構,影響結果準確性[11]。而選擇聯合應用固相萃取與固相表面熒光檢測能夠防止防止溶劑引入洗脫目標組分,能夠直接熒光檢測聚集在吸附劑表面的藥物組分,因此有助于樣品損失量降低，防止出現溶劑效應，并且有助于結果準確性的提升[12]。

考慮到溶液環境中熒光強度較弱,針對部分弱熒光性藥物分子,不可以在常規熒光方法下進行檢測。選擇固相表面熒光技術、固相萃取分離富集兩種方法聯合應用能夠解決這一問題，固相萃取－固相表面熒光法、溶液熒光法能夠同時檢測強熒光性速尿靈、弱熒光性阿米絡利。選擇尼龍膜當作操作中的固相基質材料，尼龍膜能夠富集阿米絡利，濾液中速尿靈保留下來,尼龍膜上吸附存在的阿米絡利分子剛性、熒光發射強度明顯增加，通過固相表面熒光法能夠實施直接的檢測，相比之下，溶液中相同濃度的阿米絡利幾乎沒有熒光發射峰,見圖1、圖2。根據這一結果建立起來的分析法對阿米絡利的富集倍率為1500倍,檢出限在0.1 μg/L以下,對于分析測定痕量阿米絡利非常適用。

圖1 尼龍膜上阿米絡利（0.8mg/L）激發a和發射b光譜，尼龍膜的熒光發射背景c，阿米絡利溶液（0.8mg/l）的激發d和發射e光譜

針對不同藥物分子之間、藥物分子與基體之間存在的熒光廣譜重疊問題,借助固相萃取的選擇性分離這一機制也能夠有效解決。通過熒光法對血清中吡羅昔康進行測定,血清基體的熒光發射對吡羅昔康的熒光光譜形成影響,且影響較大[13]。通過C18固相萃取膜借助C18鍵以及硅膠的疏水性能夠使吡羅昔康樣品溶液選擇性保留非極性吡羅昔康，同時能夠分離于基質，進而能夠通過固相表面熒光法對C18表面保留的吡羅昔康進行檢測。

圖2 固相表面熒光檢測系統固體支架示意圖

4 討論

采用固相表面熒光法進行藥物分析,能直接測定固體樣品,具有廣闊的應用前景,建議推廣使用。要想順利實施固相表面熒光分析,或者選擇兩種技術進行聯合分析,必須確定適合的固相基質材料，尼龍膜、葡聚糖凝膠、硅膠等一直是當前應用比較廣泛的基質材料,但是其僅能夠用于對有限的藥物組分進行分析[14]。所以在往后的研究中，應該注重研究開發更多新型的材料,這些材料不僅應該有較高的合成光學透明度,還應該能夠選擇性吸附藥物。通過化學改進、表面修飾等技術的應用，促使基質材料吸附選擇性逐漸提升,將其熒光背景減弱,因而藥物分析中固相表面熒光應用范圍會得以提升。

固相填充材料選擇合理除了能夠富集部分特定目標組分，還能夠分離與檢測多元目標組分，特別針對簡單二元混合物體系，無需色譜分離，通過簡單的固相表面熒光檢測裝置就可以分離、檢測以及富集。對于現代藥物分析工作，樣品基體的要求逐漸復雜多樣,所以固相表面熒光分析法也應該注重結合其他分析技術包括增敏、衍生、分離以及富集,形成具備靈活性以及多樣性的在線分析模式,能夠快速檢測復雜基體樣品中存在的不同種藥物組分，使其可以一起完成測定。