外泌體miRNA-21對非小細胞肺癌風險預測價值的研究

何鑫 ，榮昊 ，任偉宏 ，李延卿 ，李文博 ，馮倩 ，馮慧潔 ，劉朝陽

（1.鄭州大學第五附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450000）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,嚴重危害人類公共衛(wèi)生健康[1]。盡管當今社會診斷技術(shù)日益進步、新型藥物不斷研發(fā)，但肺癌的總體生存率仍然不盡人意[2,3]。2012年全球肺癌死亡人數(shù)高達1.59億，占所有癌癥死亡人數(shù)的19.4%。非小細胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要類型，占肺癌總發(fā)病率的85%。迄今為止，絕大多數(shù)NSCLC患者在初診時就已經(jīng)處于中晚期，而現(xiàn)有的治療往往只是暫時控制癥狀，5年生存率僅為15.9%[4]。然而，如果NSCLC患者能夠做到早發(fā)現(xiàn)、早治療,其生存質(zhì)量以及生存周期都會得到顯著改善，因此，基于外周血的生物診斷標志物正在變得越來越有前景。

外泌體是一種直徑范圍在30～100nm之間的極微小的納米級囊泡結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)，外泌體存在于大多數(shù)體液中，包括腦脊液、母乳、血液、尿液、唾液、羊水和胸腹水積液。在外周血中，外泌體濃度約為3×106/μl。外泌體從多種細胞中排出，包括紅細胞、血小板、淋巴細胞、樹突細胞和癌細胞，但癌細胞具有高度活躍的生物學活性，因此其外泌體分泌量遠超其它正常細胞。某些研究已經(jīng)證明外泌體可以與受體細胞細胞膜融合，從而將外泌體內(nèi)容物插入受體細胞。在外泌體的分泌過程中,母體細胞的類型和生理病理狀態(tài)決定了外泌體的組成和結(jié)構(gòu)[5]。外泌體是多種生物分子的載體，包括蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、DNA、mRNA和microRNA。尤其重要的是，mRNA和microRNA等基因材料作為外泌體內(nèi)容物可被翻譯并調(diào)節(jié)受體或靶細胞中的基因表達[6]。現(xiàn)研究表明，microRNA通過調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄過程在許多慢性疾病以及癌癥的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[7]。人體內(nèi)的循環(huán)microRNA之所以可以在外周血中穩(wěn)定存在，是因為被微泡、外泌體等囊泡包裹，或者與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，免于受到血液中核糖核酸酶（Rnase）的降解以及溫度、酸堿度等不利因素的干擾[8-10]。正是因為NSCLC患者外周血中含有大量肺癌細胞來源的外泌體,本研究通過檢測外泌體中的特異性microRNA來對NSCLC進行早期預測。

EGFR基因是ERBB家族中的一員，對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要作用[11]。如果EGFR基因過表達或者發(fā)生突變,將導致信號傳導通路的異常，進一步導致胞核DNA過度復制和細胞過度分裂,最終引起細胞惡化,形成腫瘤[12]。EGFR基因突變不僅導致NSCLC的發(fā)生,且影響整個病程的進展，具有促進腫瘤生長、分化、浸染的作用。在所有NSCLC患者中，組織EGFR基因突變與外周血EGFR基因突變一致率為70～80%，這與腫瘤細胞在組織中的分布以及取樣位置有很大關(guān)系,而來源于壞死腫瘤細胞的ctDNA會不可避免地進入人體外周血,因此可以很好地反映整個病灶的完整信息[13]。本研究將就外周血EGFR基因突變是否具有預測NSCLC風險的能力做出評估。

目前臨床上應用最為廣泛的具有腫瘤監(jiān)測能力的血清學標志物是腫瘤標志物，其中，與NSCLC相關(guān)的是癌胚抗原（CEA）、鱗細胞癌抗原（SCCA）和細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）[14]。CEA由內(nèi)胚層分化而來,是細胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，形成于胞漿，并通過細胞膜釋放入血液。CEA是一種非特異性血清腫瘤標志物，在許多實體瘤中表達異常，在腫瘤的診斷和療效評估中具有重要參考價值[15]。SCCA是一種來自于鱗狀上皮細胞的糖蛋白，主要用于診斷鱗狀上皮細胞癌[16]。CYFRA21-1是一種細胞角蛋白,存在于上皮細胞和來自這些細胞的惡性腫瘤細胞,是常用的NSCLC診斷標志物[17]。CEA、SCCA、CYFRA21-1是當下診斷NSCLC敏感度、特異度相對較好的血清學標志物,本文即通過ROC曲線來對比研究CEA、SCCA、CYFRA21-1及其三項聯(lián)合在NSCLC診斷中的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年6月至11月,于河南省腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤內(nèi)科收集30例確診為NSCLC患者的EDTA-K2抗凝血液標本；對照組中的30例EDTA-K2抗凝血液標本均來源于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢正常人員。

1.2 儀器與試劑 ABI7500實時熒光定量PCR分析儀，微滴式數(shù)字PCR儀，Luminex流式細胞點陣儀，超凈工作臺，低溫高速離心機；外泌體提取試劑盒 PureExo Exosome Isolation Kit（P101），外泌體RNA提取試劑盒SeraMir Exosome RNA Amplification（140710-002），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Syntesis Kit（KR211-02）,熒光PCR擴增試劑盒miRcute Plus miRNA qP CR Detection Kit（SYBR Green）,人 EGFR 基因T79 0M突變檢測試劑盒，CEA定量測定試劑盒，SCCA定量測定試劑盒，CYFRA21-1定量測定試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 分離血清外泌體 取每例受試者血清樣本400μl，共計60例，按照外泌體提取試劑盒說明書提取血清外泌體；將分離出的外泌體重懸于PBS溶液中，置于4℃冰箱以備下一步操作。

1.3.2 Western Blot檢測外泌體膜蛋白 取上步得到的外泌體懸液，經(jīng)總蛋白提取、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影等步驟，驗證所提取外泌體的膜蛋白。

1.3.3 提取外泌體RNA 按照外泌體RNA提取試劑盒seraMir Exosome RNA Amplification說明書要求提取血清外泌體中RNA；每例樣本應當獲得30～40μl外泌體RNA;每份外泌體RNA中加入1L外參。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄miRNA-21取出逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，解凍 2×miRNA RT Reaction Buffer并混勻，miRNA RT Enzyme Mix放于冰盒上備用；按照說明書要求逆轉(zhuǎn)錄miRNA-21。

1.3.5 擴增miRNA-21待試劑盒室溫融化后置于冰盒上，按照說明書配制反應體系，體系配制完成后將所有PCR反應管上機擴增。擴增所涉及的引物序列見表1。

1.3.6 PCR結(jié)果分析 分析PCR結(jié)果時，miRNA-21與外參閾值線均取0.01，閾值線與每條擴增曲線的交點所對應的橫坐標即為相應的Ct值。基因水平采用2-ΔΔCt法計算，ΔΔCt=（實驗組CtmiRNA-21-實驗組Ct外參）-（對照組 CtmiRNA-21-對照組Ct外參）。

1.3.7 EGFR突變基因檢測 取出DNA提取試劑盒TIANamp FFPE DNA Kit提取血清中EGFR基因，以此作為PCR反應模板進行擴增。擴增完成后將反應完成的體系置于微滴讀取儀中讀取結(jié)果。

1.3.8 血清腫瘤標志物 CEA、SCCA、CYFRA21-1檢測 將CEA、SCCA、CYFRA21-1檢測試劑盒和Lminex機器準備好，室溫下融化血清，混勻后立即離心；分別在96孔反應板上依次加入：A液25μl/孔，樣本或校準品 10μl/孔，B 液 25μl/孔；加樣完成后按照說明書要求在37℃恒溫箱中避光溫浴，然后加入C液25μl；最后把96孔板置于多功能流式細胞點陣儀讀取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，外泌體miRNA-21、腫瘤標志物數(shù)據(jù)結(jié)果以(x±s)表示，因?qū)嶒灲Y(jié)果均不符合正態(tài)分布，兩組間計量資料比較采用秩和檢驗,多組間計量資料比較用KW檢驗，行受試者工作特征（ROC）曲線對診斷效能進行分析。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot對外泌體膜蛋白的檢測 外泌體表面最具有特異性的膜蛋白是CD63和CD81，根據(jù)本次實驗結(jié)果顯示,所提取外泌體含有表面蛋白CD63和CD81，如圖1所示。

圖1 外泌體富含CD63和CD81

2.2 miRNA-21在NSCLC組與正常人組中的表達水平 PCR擴增結(jié)果如圖2、3所示。采用秩和檢驗分析可知，NSCLC組血清外泌體miRNA-21較正常人組表達明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為3.06倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 2。

圖2 NSCLC組外泌體miRNA-21擴增曲線（左）和溶解曲線（右）

2.3 外泌體miRNA-21對NSCLC的診斷價值分析對外泌體miRNA-21表達水平進一步行ROC曲線分析,結(jié)果表明外泌體miRNA-21預測NSCLC風險價值高,曲線下面積為 87.6%（P＜0.05），95%置信區(qū)間為0.784～0.968。當miRNA-21表達水平為54.71時,可得出最佳敏感度(80%)和特異性(86.7%)。 見圖 4。

圖3 正常人組外泌體miRNA-21擴增曲線（左）和溶解曲線（右）

表2 NSCLC組與正常人組外泌體miRNA-21對比分析

圖4 外泌體miRNA-21預測NSCLC風險的ROC曲線

2.4 肺癌驅(qū)動基因EGFR突變檢測結(jié)果 30例NSCLC患者中EGFR基因突變共13例，其中，18號外顯子突變2例，19號外顯子突變6例，20號外顯子突變1例，21號外顯子突變3例，19、20號外顯子聯(lián)合突變1例，總突變率為43.3%；30例正常人中則沒有發(fā)生EGFR基因突變，見表3、表4。

2.5 肺癌相關(guān)腫瘤標志物CEA、SCCA、CYFRA21-1檢測結(jié)果 見表5。

2.6 CEA、SCCA、CYFRA21-1對 NSCLC 的風險預測分析 CEA曲線下面積為52.1%,SCCA曲線下面積為65.0%,CYFR A21-1曲線下面積為60.9%，三項聯(lián)合曲線下面積為77.3%,95%置信區(qū)間為0.655～0.891。 可知 CEA、SCCA 或 CYFRA21-1單項在預測NSCLC風險方面并不可靠，但是如果三項聯(lián)合診斷，可明顯提升診斷效能。見圖5。

表3 NSCLC患者EGFR基因突變結(jié)果

表4 正常人EGFR基因突變結(jié)果

表5 NSCLC組與正常人組血清CEA、SCCA、CYFRA21-1

圖 5 血清 CEA、SCCA、CYFRA21-1 及三項聯(lián)合預測NSCLC風險的ROC曲線

3 討論

外泌體被認為是普遍存在于人體各種體液，包括母乳、唾液、血清、羊水、惡性腹水和尿液等多種液體中均含有大量可分離的外泌體[18]。外泌體可以作為診斷和治療工具應用于臨床。細胞在正常和病態(tài)條件下均分泌外泌體。外泌體攜帶包含供體細胞病理信息的各種核酸和蛋白質(zhì),這些核酸和蛋白質(zhì)被認為是具有實驗和臨床診斷價值的生物標志物。在本項研究中，NSCLC患者組血清外泌體miRNA-21表達水平為119.6498.35,顯著高于正常人組的39.1034.12，證明血清外泌體miRNA-21是NSCLC患病的高危預測因素，這與NSCLC腫瘤組織或腫瘤細胞中的結(jié)果一致[9,10]。實驗結(jié)果充分表明外泌體作為液體活檢技術(shù)的生物學意義,以及miRNA-21在NSCLC發(fā)病機制中發(fā)揮著巨大作用。我們推測，其機制可能是miRNA-21抑制細胞的分化并誘導細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化,最終導致癌癥的發(fā)生。肺癌細胞源性外泌體通過刺激細胞增殖、血管生成、細胞外基質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)移和免疫監(jiān)視逃逸來促進腫瘤進展,并通過轉(zhuǎn)移致癌生物分子如miR NA-21作為其內(nèi)容物來影響受體細胞。在進入靶細胞后，這些腫瘤來源的內(nèi)容物有助于在受體細胞中發(fā)展癌癥表型，引起受體細胞惡變[19]。

近年來，EGFR突變基因檢測在肺部腫瘤相關(guān)疾病中進行得如火如荼。EGFR基因位點發(fā)生突變，會刺激細胞發(fā)生惡變，開始無休止的增殖，最終導致癌癥的發(fā)生[20,21]。相比較于其他癌癥，EGFR在NSCLC患者中突變率尤其高，因此，本項研究對30例NSCLC患者和30例正常人外周血EGFR基因突變情況進行檢測。結(jié)果表明，在30例NSCLC患者中，EGFR基因總突變率為43.3%,而在正常人中，沒有發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變。因此我們可以得出結(jié)論,用EGFR基因突變作為NSCLC的風險預測指標具有極好的特異性,但在隨機選取的30例NSCLC患者中,有56.7%的患者不存在EGFR基因突變,因此用EGFR基因突變作為NSCLC的風險預測指標存在極大的漏診率,僅可以作為參考指標。

腫瘤標志物是當今用于腫瘤檢測的最為廣泛且相對有效的血清學標志物,其中與NSCLC最具相關(guān)性的是CEA、SCCA、CYFRA21-1。本研究對CEA、SCCA、CYFRA21-1在NSCLC風險預測中的價值行ROC曲線分析,結(jié)果顯示,CEA、SCCA、CYF RA21-1的曲線下面積分別為：52.1%、65.0%和60.9%，均不可作為NSCLC的預測指標。三者聯(lián)合起來，作為一個聯(lián)合診斷指標，再次行ROC曲線預測NSCLC風險，曲線下面積顯著提升至77.3%，從理論上講可以作為NSCLC的診斷指標，但是由于在臨床上實際操作起來需要復雜的運算、缺乏統(tǒng)一標準的診斷界點,且診斷效能明顯低于外泌體miRNA-21，所以仍不推薦使用。

外泌體miRNA-21具有較高的NSCLC風險預測價值，而EGFR基因突變、肺癌相關(guān)腫瘤標志物的NSCLC風險預測價值相對較低