ASC-US患者HPV感染與Th17/Treg細胞及炎癥因子的變化分析

馬梅 ，張德陽 ，許德清 ，蔣蕾 ，薛芬 ，薛峰

（1.南陽市臥龍區計劃生育宣傳技術服務站婦科，河南 南陽473000；2.南陽市第二人民醫院病理科，河南 南陽473000；3.南陽市第二人民醫院產一科，河南 南陽 473000；4.南陽市醫學高等專科學校第一附屬醫院放射科，河南 南陽 473000；5.南陽市第一人民醫院康復科，河南 南陽 473000；6.南陽市宛城區疾病控制中心，河南 南陽 473000）

流行病學研究證實,非典型鱗狀細胞(ASC-US)的發病率可達283～593/1萬人左右[1]。臨床上ASCUS的發生能夠增加患者宮頸高級別病變的發生風險,提高遠期宮頸惡性腫瘤的發生率[2]。在探討A SC-US的發生或者病情進展機制的過程中發現，人乳頭瘤狀病毒（HPV）的感染，能夠通過促進宮頸柱狀上皮細胞的損傷和DNA的擴增，進而促進宮頸病變的發生[3]；輔助性T淋巴細胞（T17）是T淋巴細胞亞群的重要成員,其能夠通過促進體內炎癥因子的釋放，加劇宮頸上皮組織的炎癥性損傷，進而促進宮頸病變的發生[4]；調解性T細胞（Treg）是CD4 T淋巴細胞亞群的重要成員,其能夠通過對于T淋巴細胞免疫的調控作用導致細胞免疫功能的紊亂，導致免疫抑制和免疫逃逸的發生[5]。部分研究者探討了高危型HPV病毒感染與ASC-US的關系,認為高危型HPV病毒感染是促進ASC-US病情進展的重要因素[6]，但對于Th17、Treg細胞與宮頸病變的關系研究不足。為了深入揭示Th17、Treg細胞與ASC-US的關系,從而為臨床上宮頸病變的預防和治療提供參考,本次研究選取我院婦科門診2017年3月至2017年12月收集的200例ASCUS患者，探討了HPV病毒亞型、Th17、Treg細胞表達情況，報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月至2017年12月于我院婦科門診收集的200例ASC-US患者，根據宮頸活檢組織學診斷將其分為宮頸炎性病變患者52例 (炎性組)、宮頸上皮內瘤變患者133例（CIN組）、宮頸癌患者15例（宮頸癌組）。炎性組，年齡29～68歲，平均37.6±11.7歲。CIN組，年齡26～65歲，平均39.0±12.2歲，其中CINⅠ級39例、CINⅡ級60例、CINⅢ級34例。宮頸癌組,年齡31～66歲,平均40.2±10.8歲。三組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：⑴宮頸炎、CIN患者、宮頸癌患者的診斷標準參考《婦產科學》人民衛生出版社第八版中的標準;⑵所有研究對象均接受了薄層液基細胞學（TCT）、宮頸活組織病理學檢查；⑶納入研究對象的年齡19～69歲;⑷本研究獲得研究對象的知情同意、醫學倫理委員會的批準。排除標準：⑴既往具有宮頸手術史；⑵盆腔及卵巢惡性腫瘤；⑶急慢性感染性疾病；⑷免疫系統疾病。

1.2 HPV檢測方法 采用美國Digene公司二代雜交捕獲試驗(hybrid capture,HC-II)的采樣工具,宮頸管采集標本,進行HC-II檢測操作并作出分析。檢測目前已知的13種高危型HPV。HPV≥1.0 ng/L為檢測陽性。

1.3 Th17/Treg細胞檢測 采集患者清晨空腹血5ml，置于肝素鈉抗凝管中，采用流式細胞儀雙標法進行CD4+CD25+調節性T細胞的檢測。相關標記操作于5ml抗凝管中進行，100μl全血與CD4-FITC/CD25-PE抗體室溫反應25min,采用紅細胞裂解液optiLYse C溶血素溶解紅細胞，PBS液體洗滌三遍，每次5min，生理鹽水重新懸浮細胞，上機檢測。(FACS calibur流式細胞儀購自美國BD公司，threg檢測試劑盒購自羅氏檢測公司）。

采用ficoll法分離人外周血T淋巴細胞，取20μl細胞混合液加入錐蟲藍,加入離子霉素后植入培養箱中培養1h，加入莫能霉素，繼續培養5h。取200μl細胞懸浮液,加入 10μl固定液，加入 30μl細胞裂解液,反應20min之后1000r/min離心5min(離心半徑15cm),加入25μl IL-17 FITC/CD4 PE抗體進行標記，孵育30min后上機檢測。（th17檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司）

1.4 炎癥因子檢測 采集入院后靜脈血，1000r/min離心5min，離心半徑10cm，離心后收集上清液，采用免疫發光法檢測 IL-17、TGF-β、IL-23水平，加入檢測試劑，檢測儀器為美國Bio-Bad全自動酶標儀,配套試劑盒購自羅氏檢測公司,微型離心機HIT ETIC購自上海精密儀器有限公司。

1.5 統計學方法 數據統計、分析應用SPSS16.0，應用(x±s)表示計量數據，計量數據的比較分析采用單因素方差分析法,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患者HPV感染型別分析 宮頸癌組患者的HPV16型、HPV52型均顯著高于CIN組和炎性組（P<0.05），CIN 組患者的 HPV16型、HPV52型均顯著高于炎性組（P<0.05）；宮頸癌組、CIN組和炎性組患者的HPV18型、HPV58型感染率差異無統計學意義（P>0.05）；見表 1。

表1 三組患者HPV感染型別分析[n（%）]

2.2 三組患者Th17/Treg細胞比較 宮頸癌組患者的外周血中CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg、Th17/Treg細胞均顯著的高于CIN組和炎性組（P<0.05），CIN 組患者的 CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg、Th17/Treg均顯著的高于炎性組（P<0.05）；見表 2。

表2 三組患者Th17/Treg細胞比較（x±s）

2.3 三組患者血清細胞因子比較 宮頸癌組患者的血清IL-17、TGF-β、IL-23均顯著高于CIN組和炎性組(P<0.05),CIN組患者的血清IL-17、TGF-β、IL-23均顯著高于炎性組（P<0.05）；見表3。

表3 三組患者血清細胞因子比較（x±s）

3 討論

宮頸柱狀上皮細胞的持續性異常分裂,能夠促進宮頸惡性腫瘤的發生，特別是在合并有HPV16、HPV18及HPV52等感染的患者中，宮頸癌的發生風險更高[7]。臨床上的長期觀察認為，宮頸癌的五年生存率不足35%,包括手術在內的相關綜合性治療措施治療后的無瘤生存時間不足36個月[8]。免疫靶向治療能夠在惡性腫瘤的診療過程中發揮重要的作用，其能夠抑制腫瘤的復發，提高患者的整體生存預后水平。而本次研究對于宮頸癌患者體內的相關因子的表達分析,能夠為臨床上宮頸癌的免疫靶向治療提供理論基礎。

HPV16、HPV52等高危型病毒的感染，能夠促進癌細胞快速跨越G0期，提高了癌細胞的持續性自我增殖的風險。高危型HPV病毒感染導致的宮頸柱狀上皮整合作用,能夠提高柱狀上皮細胞浸潤和突破基底膜組織的能力[9]；Th17淋巴細胞能夠通過對于炎癥性因子的調控和釋放,進而促進柱狀上皮細胞的病變，Th17細胞分泌的IL-17或者腫瘤壞死因子,均能夠促進柱狀上皮細胞的持續性DN A擴增，導致癌基因錯配修復能力的下降，促進了上皮細胞的異常分化過程[10]；Treg細胞是 CD4亞群的重要成員,其對樹突狀細胞的抗原提呈功能的調控，能夠抑制自身T淋巴細胞的免疫能力，降低其對HPV病毒顆粒的清除作用[11]。

本次研究對宮頸病變患者不同高危型HPV亞型的分析可見，在宮頸上皮內瘤變（CIN）及宮頸癌患者中，HPV16型、HPV52型陽性率明顯上升，高于良性宮頸上皮組織,其中宮頸癌患者中的HPV 16型、HPV52型陽性率更高,提示了高危型HPV病毒感染對于宮頸病變的影響。但本次研究中并未發現HPV18亞型的差異,這可能考慮與不同地區的流行病學的差異有關[12]。對于免疫性指標的相關研究可見,在CIN及宮頸癌患者中，CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率和 Th17/Treg比例均明顯上升,提示了免疫性因素對于宮頸病變發生的影響。通過匯集不同的相關文獻,筆者認為這主要與相關免疫細胞的下列作用有關[13]：⑴CD4+IL17+Th17的上升能夠通過促進IL-17的合成和釋放，促進了其對于宮頸上皮DNA的損傷作用，導致癌基因的擴增速度明顯的上升；⑵CD4+CD25+Foxp3+Treg的上升,能夠導致th1/th2免疫平衡的紊亂,導致樹突狀細胞抗原提呈作用的下降，促進了宮頸癌上皮細胞的免疫逃逸過程。徐浩等[14]研究者也認為，在宮頸癌患者中，Th17淋巴細胞的陽性率可平均上升30%以上,特別是在病程較長或者合并有明顯的宮旁組織浸潤的患者中，其表達陽性率可進一步的上升。Th17/Treg的上升則提示Th17淋巴細胞的上升明顯高于Treg的上升幅度，推測Th17淋巴細胞在宮頸病變的過程中發揮了更為顯著的促進作用。但部分研究者并不認為CD4+CD25+Foxp3+Treg可明顯上升,認為在宮頸癌患者中,存在明顯的免疫抑制,CD4+CD25+Foxp3+Treg可明顯下降，存在不同的臨床結論，考慮可能與宮頸癌患者的臨床分期或者指標檢測時機的不同有關。白細胞介素17（IL-17）、轉化生長因子 β（TGF-β）及白細胞介素 23（IL-23）是炎癥性效應因子，在CIN組及宮頸癌患者中，IL-17、TGF-β、IL-23的表達均明顯上升，特別是宮頸癌患者中的表達更為明顯，提示炎癥反應的激活，能夠在促進宮頸持續性病變過程中發揮重要作用。這主要由于IL-17、TGF-β、IL-23相關因子的上升,能夠影響癌細胞的生物學特征,導致癌細胞的浸潤和增殖能力的增強，進而促進了病情的進展[15]。

本次研究的創新性在于探討了宮頸病變患者中Th17、Treg細胞的表達情況。綜上所述,宮頸癌組織中HPV16型、HPV52型感染率較高,體內的Th17、Treg細胞明顯上升，同時存在明顯的炎癥反應激活。