非小細胞肺癌化療患者Nrf2表達與遠期療效臨床分析

程治強，崔恩華，白衛云

（1.河南省直屬機關第一門診部胸外科，河南 鄭州 450000；2.河南省榮軍醫院腫瘤科，河南 新鄉453000；3.河南省第二人民醫院腫瘤科，河南 新鄭 451191）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NS CLC）的五年生存率較低，中位生存時間較短，遠期生存預后不佳[1]。流行病學研究顯示,NSCLC的發病率可達0.006%～0.012%左右,且在部分地區NSC LC的發病率呈現出一定的上升趨勢[1]。在對于NS CLC發病過程中相關生物學機制的研究發現，不同生物學因子的激活可以通過提高癌細胞的增殖活性、促進其對于淋巴結的浸潤而加劇病情的進展[2]。核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是協同刺激分子，其可以通過對于氧化應激反應的誘導作用,促進癌細胞的持續性擴增，導致其遠處轉移等的風險增加。相關研究已經證實，Nrf2的表達在促進卵巢癌、甲狀腺癌等上皮細胞惡性腫瘤中發揮重要作用,認為高表達的NRF2能夠促進癌細胞增殖速度的改變[3]，但對于Nrf2的表達與肺癌臨床病理特征的關系研究仍鮮有報道。為了進一步揭示Nrf2在促進NSCLC發生發展中的作用，本研究通過檢測Nrf2在NSCLC患者中的表達變化,并分析探討其與患者中位生存時間的關系,以期為臨床肺癌患者的預后評估提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2016年4月在我院接受化療治療的NSCLC患者87例，其中男性52例,女性35例;年齡49～71歲,平均年齡(61.20±5.43)歲；鱗癌 48例,腺癌 30例,大細胞癌 9例；Ⅲ期39例，Ⅳ期48例。納入標準：⑴經支氣管鏡活檢或CT穿刺肺組織后病理確診為NSCLC；⑵符合中華醫學會制定的相關標準[4]；⑶均接受含鉑的雙藥化療方案；⑷預計生存期＞3個月；⑸患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：⑴既往有惡性腫瘤史、接受過放化療者；⑵預計生存期＜3個月。

1.2 檢測方法 采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3μm，3%H2O2室溫孵育 5 min，采用去離子水沖洗3次，每次3min，用濃度為1%BSA封閉液（南京碧云天生物有效公司）封閉,室溫孵育 5min,加入Nrf2抗體(鼠源,南京碧云天生物科技有限公司),37℃ 孵育2h,PBS緩沖液沖洗3次,每次5min,滴加HRP標記的二抗(兔源,羅氏檢測公司),37℃ 孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min,加入NBT/BCIP色劑顯色5min，復染，脫水，于透明玻片封片，鏡下觀察。OLIPICS光學顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.3 免疫組化結果判斷 在高倍鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數,每個視野計數200個腫瘤細胞，染色強度分為：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例分為0～100%。參照陳杰[5]的免疫組化評判標準將細胞核染色強度和陽性比例乘積進行評價,乘積大于0.25為Nrf2陽性表達，小于0.25為陰性。

1.4 療效評價 近期療效以化療4個周期后按照實體瘤療效評價標準1.1版評價[6]，分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、疾病穩定(stable disease,SD)和疾病進展(progressive disease,PD);遠期療效采用總生存期(overall survival,OS)評價，OS指化療開始至死亡或隨訪終點時間。末次隨訪時間為2017年2月1日。

1.5 統計學分析 數據分析應用SPSS19.0軟件進行統計分析,計數資料采用百分比或頻數表示,組間比較使用χ2檢驗,Kaplan-Meier法進行生存曲線分析,比較采用Log-rank檢驗,多因素分析采用Cox回歸分析,P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Nrf2表達與患者臨床特征的關系≥60歲患者Nrf2陽性表達率為53.19%,明顯高于＜60歲患者的12.50%,Ⅳ期患者Nrf2陽性表達率為47.92%,明顯高于Ⅲ期患者的17.95%（P＜0.05）；不同性別、病理類型、分化程度、化療方案及近期療效患者Nrf2陽性表達差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 Nrf2表達與遠期療效關系 隨訪期間，Nrf2表達陽性和陰性患者分別死亡18例和28例，Kaplan-Meier生存分析顯示，Nrf2表達陽性患者中位OS 為 13 個月(95%CI：11.80～14.20)，Nrf2 表達陰性患者中位 OS 為 19 個月（95%CI：16.67～21.33），差異比較有統計學意義（χ2=8.460，P=0.004），見圖 1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線圖

2.3 多因素分析 COX多因素分析結果顯示,病理類型及Nrf2表達為NSCLC患者預后的預測因素。與肺鱗癌患者相比，腺癌患者死亡風險降低（OR=0.462，95%CI=0.183～0.953），差異具有統計學意義（P<0.05）；與Nrf2陰性患者相比，Nrf2陽性患者死亡風險升高(OR=1.806，95%CI=1.123～3.592)，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 Nrf2表達與患者臨床特征的關系

3 討論

NSCLC的發生,主要與吸煙、遺傳基因突變或者家族史等有關，NSCLC容易早期發生淋巴結或者血行的轉移，臨床預后較差[7]。臨床回顧性分析研究表明，NSCLC的五年生存率不足35%，中位生存時間不足32個月[8],迄今臨床上缺乏對于NSCLC患者的早期診斷或者預后的相關評估指標。本次研究通過對相關指標進行研究,為臨床上NSCLC術后重點人群隨訪提供參考。

Nrf2是協同共刺激分子家族成員,能夠通過影響癌細胞的生物學特征，進而促進癌細胞的擴散，同時Nrf2對于癌細胞對淋巴結內皮細胞浸潤能力的促進作用,可加劇癌細胞淋巴結轉移或者遠處轉移的風險[9,10]。Nrf2結構上包含了多個重復的巰基結構,能夠通過與癌細胞膜表面的糖蛋白受體結合，促進癌相關基因的轉錄，引起細胞凋亡的抑制[11,12]。此外，臨床分期越晚，Nrf2陽性表達率越高[13]。

本研究通過免疫組化分析研究Nrf2的表達與肺癌患者臨床病理特征的關系,結果發現Nrf2與肺癌患者的病理類型、分化程度等臨床特征并無明顯的關聯,提示Nrf2可能并不會影響到癌細胞的來源,同時Nrf2的表達對于肺癌上皮細胞早期分化的調控作用也可能不明顯，這與賈小婷等[14]研究者在探討部分早期肺部浸潤性癌的臨床免疫組化資料時報道的Nrf2表達對于癌細胞分化抑制作用并不明顯結果相符。本研究中，≥60歲、Ⅳ期患者的Nrf2陽性表達率要分別明顯高于＜60歲年齡段、臨床TNM分期較早的患者，差異均具有統計學意義（P<0.05），提示Nrf2可以促進肺癌臨床分期的進展，并可能與發病年齡具有內在的相關性。相關研究表明[15]，臨床分期越晚，Nrf2的上升越為明顯,這些均證實了Nrf2的表達與患者臨床分期的關系。Nrf2陽性表達對于患者臨床分期的影響，主要與Nrf2陽性的表達對于癌細胞的侵襲或者轉移能力的改變有關[15]。在評估Nrf2對患者遠期生存預后時間的影響中,本研究發現Nrf2的表達與患者的中位生存時間具有密切的關系，Nrf2的陽性率越低，中位生存時間越長，考慮可能與下列因素有關：Nrf2的陽性表達，增強了殘留癌細胞的復發活性，導致癌細胞遠期復發風險的增加；Nrf2的高表達,促進了肺癌細胞對于臨近正常肺部組織的浸潤，導致殘留肺功能的降低，患者病死率或者生存時間進一步惡化。此外，COX多因素分析結果顯示,病理類型及Nrf2的表達是患者OS的預測因素,進一步提示除了病理類型可以影響到肺癌患者的遠期預后，Nrf2也可以有效指導評估患者的生存預后風險。但部分研究并未發現Nrf2的表達與患者生存預后的關系，考慮可能與樣本量的限制、臨床資料的分布偏移等有關[16]。

綜上所述，Nrf2在NSCLC患者中異常表達，其表達與患者的臨床分期或者年齡具有密切的關系,同時Nrf2的表達可以在一定程度上指導肺癌患者的遠期臨床預后。

表2 影響NSCLC患者OS的多因素Cox分析