長期施肥對旱地紅壤細菌群落的影響*

劉 佳，陳曉芬，劉 明，吳 萌，王伯仁，蔡澤江，張桃林，李忠佩?

長期施肥對旱地紅壤細菌群落的影響*

劉 佳1，2，3，陳曉芬1，2，3，劉 明1，吳 萌1，王伯仁4，5，蔡澤江4，5，張桃林1，2，李忠佩1，2?

（1. 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 江西省農業科學院土壤肥料與資源環境研究所/國家紅壤改良工程技術研究中心，南昌 330200；4. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；5. 祁陽農田生態系統國家野外科學觀測研究站，湖南祁陽 426182）

為探討長期不同施肥對旱地紅壤細菌群落的影響，以中國農業科學院祁陽紅壤實驗站的冬小麥—夏玉米定位試驗為研究對象，選取不施肥（CK）、單施氮肥（N）、施化學氮磷鉀肥（NPK）和化學氮磷鉀+有機肥配施（NPKM）4個處理，于試驗開展25年（2015年）小麥收獲后采集各處理0～20 cm的土壤樣品，利用Illumina MiSeq高通量測序技術對土壤細菌群落進行測定，并深入揭示影響旱地紅壤細菌群落的關鍵因素。結果表明：（1）長期不同施肥顯著改變了旱地紅壤的化學性質，N和NPK處理的土壤pH顯著降低至4.02和4.15，而NPKM處理的土壤pH顯著上升至5.99。NPK和NPKM處理均顯著改善土壤肥力，但后者效果明顯優于前者，而N處理對土壤肥力的提升效果微弱。（2）長期不同施肥改變了旱地紅壤優勢菌的相對豐度，非度量多維度分析（NMDS）和相似性分析（ANOSIM）表明不同處理的土壤細菌群落發生顯著變化。（3）與CK相比，N處理的4種多樣性指數（物種豐富度、Chao1指數、系統發育多樣性和香農指數）顯著降低了21.4%～49.4%，而NPKM處理顯著增加了7.0%～66.9%，NPK處理也會使系統發育多樣性和香農指數顯著降低10.3%和13.0%。（4）逐步回歸分析表明土壤pH是決定優勢菌相對豐度及4種多樣性指數的首要因素，多元回歸樹分析（MRT）探明土壤pH共解釋了83.1%的細菌群落變異，不同處理間細菌群落轉變均由土壤pH驅動。（5）STAMP分析發現，N、NPK和NPKM處理與CK分別有11、14和8個顯著差異細菌屬。綜上所述，長期施肥后旱地紅壤細菌群落主要受土壤pH的影響，而土壤肥力的作用相對較弱，長期施用化學氮肥造成的紅壤酸化的負面效應已遠超肥力改善的正面效應。因此，旱地紅壤施肥應以防治土壤酸化為前提，長期化肥有機肥配施是一項適宜的施肥措施。

長期施肥；旱地紅壤；細菌群落；高通量測序；土壤pH

紅壤是我國南方熱帶、亞熱帶地區的典型土壤，總面積148萬km2，占全國耕地總面積的36%，其中旱地農田約占紅壤區耕地總面積的40%[1]。由于強烈的風化淋溶，紅壤具有酸性強、有機質含量低、養分匱乏等特征[2]；近幾十年來的過度開發和不合理利用，又進一步加劇了紅壤退化。因此，盡管南方紅壤區光、熱、水等自然條件優越，卻難以得到充分發揮，紅壤旱地作物如小麥[3]、玉米[4]、花生[5]等的平均產量也遠低于我國北方地區。改良紅壤性狀、提高紅壤生產力，是實現我國南方紅壤區農業可持續發展的關鍵。

施肥是農業生產中提高土壤肥力、增加作物產量的常用措施，合理施肥可促進土壤生態系統的正向發展，但施肥不當會引起土壤酸化、養分失衡等一系列環境問題。微生物作為土壤生態系統的重要組分，在土壤肥力的形成，有機質的分解、轉化與固定，養分的生物地球化學循環中發揮著重要作用[6]。土壤微生物對環境變化極其敏感，關注施肥對土壤微生物群落的影響是近年來的研究熱點。許多研究表明，施肥改變了土壤肥力狀況，養分含量變化如土壤有機碳[7-8]、總氮[9-10]等直接驅動了土壤微生物群落轉變，增加或降低了微生物群落多樣性；但也有研究認為，施肥通過改變土壤性質間接作用于土壤微生物[11]，Zeng等[12]發現施氮造成的土壤pH降低是導致細菌群落變化的主要原因，Sun等[13]發現砂姜黑土長期施肥后引起土壤細菌群落轉變的pH閾值為5.74，Ma等[14]發現施肥造成的土壤C:P和N:P變化決定了土壤微生物群落組成。此外，施肥還可能通過影響地上植物作用于地下微生物[12]。可見，施肥對土壤微生物群落的影響存在多種途徑，具體的影響效果及關鍵因素具有不確定性，這可能與土壤類型、施肥措施和種植制度等有關，因此需要開展針對性研究予以探明，這對于科學評估施肥效果、及時有效調整施肥策略具有重要意義。

土壤微生物研究長期以來受到技術方法的嚴重制約[15]，近些年來高通量測序技術取得重大突破，使完整精準破譯土壤微生物的遺傳信息成為可能。因此，本研究采用當下迅速發展的Illumina MiSeq高通量測序技術，以中國農業科學院祁陽紅壤實驗站的定位試驗為對象，研究長期施肥對旱地紅壤細菌群落的影響，探明驅動細菌群落變化的關鍵因素及其影響閾值，揭示響應不同施肥措施的特異微生物種類，以期為我國南方旱地紅壤的合理施肥和可持續利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗區位于湖南省祁陽縣中國農業科學院祁陽紅壤實驗站（26°45′12″ N，111°52′32″ E）。該區域屬典型的亞熱帶濕潤季風氣候，年均氣溫18.0℃，≥10℃的積溫5 600 ℃，年均降水量1 255 mm，蒸發量1 470 mm，無霜期約300 d，日照時數約1 610 h[16]。長期施肥定位試驗開始于1990年，供試土壤為第四季紅黏土母質發育的紅壤，試驗開始時0～20 cm土壤的基礎化學性質為：pH 5.70，土壤有機碳（SOC）6.06 g·kg–1，全氮（TN）1.07 g·kg–1，全磷（TP）0.52 g·kg–1，全鉀（TK）13.7 g·kg–1，堿解氮（AN）79.0 mg·kg–1，有效磷（AP）13.9 mg·kg–1，速效鉀（AK）104 mg·kg–1[17]。

1.2 試驗設計與樣品采集

本研究選取長期施肥定位試驗中的4個處理：①不施肥（CK），②單施氮肥（N），③施化學氮磷鉀肥（NPK），④化學氮磷鉀+有機肥配施（NPKM）。肥料年施用量為：N 300 kg·hm–2、P2O5120 kg·hm–2和K2O 120 kg·hm–2。在NPKM處理中，30%的N來源于化肥，70%的N來源于有機肥，即保證總施氮量不變。氮肥使用尿素（含N 46%），磷肥使用過磷酸鈣（含P2O512%），鉀肥使用氯化鉀（含K2O 60%），有機肥使用豬糞（每年施用前測定其含N量）。試驗的種植制度為冬小麥—夏玉米輪作。玉米季的化肥施用量占總施用量的70%，小麥季占30%，但有機肥均在小麥季施用，所有肥料在作物種植前一次性基施。試驗小區面積為196 m2，兩次重復。

在2015年5月小麥收獲后采集土壤樣品。采樣時每小區分作2個半區進行，每個半區用土鉆按“S”形采集0～20 cm土樣10份，徹底混勻后作為一個樣品，即每處理獲得4個重復樣品。土樣采集后盡快帶回室內，揀除雜質后過2 mm篩，而后將每個樣品分為兩份：一份風干用于測定土壤化學性質，一份保存在?80℃的冰箱中用于提取土壤DNA。

1.3 土壤化學性質測定

土壤化學性質的測定參照魯如坤[18]的方法進行。土壤pH采用電位法測定（水︰土=2.5︰1），土壤有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀氧化—容量法測定，全氮（TN）采用凱氏定氮法測定，全磷（TP）采用碳酸鈉熔融法測定，全鉀（TK）采用氫氧化鈉熔融法測定，堿解氮（AN）采用堿解擴散法測定，有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定，速效鉀（AK）采用乙酸銨浸提—火焰光度法測定。

1.4 土壤DNA的提取和16S rRNA基因的高通量測序

稱取0.5 g土壤樣品用FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，美國）進行DNA提取，具體方法和步驟參照試劑盒說明書進行。采用特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCG G-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對細菌16S rRNA基因的V4-V5區進行擴增[19]。PCR反應體系包括：PremixDNA聚合酶（5 U·μL–1）25 μL，正、反向引物（20 mg·L–1）各0.5 μL，DNA模板（20 mg·L–1）1 μL，雙蒸水補至50 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；（94 ℃45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s）×35個循環；72 ℃10 min。PCR產物用JET quick PCR產物純化試劑盒（Genomed Gmbh，美國）純化，而后使用Illumina MiSeq PE 250高通量測序平臺進行測序。

1.5 高通量測序數據分析

MiSeq高通量測序結果用QIIME軟件進行分析[20]。首先將具有相同Barcode引物的序列歸為一類樣品。將高通量測序得到的原始序列進行拼接，拼接時堿基重疊數不得少于20個，堿基配對錯誤率為0。拼接后去除q值（質量分數）低于25的低質量序列，用UCLUST對保留的高質量序列按97%的相似度進行聚類，得到細菌序列的可操作分類單元（OTU，Operational taxonomic units），選擇每個OTU中數量最多的序列作為該OTU的代表序列。采用PyNAST方法將所有代表序列對齊后建立系統發育樹并計算系統發育多樣性。用RDP Classifier將OTU代表序列與Silva的16S rRNA基因數據庫進行比對，比對可信度為0.8[21]，生成具有物種豐度信息的OTU表用于后續分析。高通量測序的原始數據保存在ENA（European Nucleotide Archive）數據庫，登記號為PRJEB30581。

1.6 數據處理

土壤化學性質、優勢菌（平均相對豐度＞1%）相對豐度、細菌多樣性等指標采用單因素方差分析、Duncan多重比較來判斷差異顯著性（<0.05）；采用逐步回歸分析揭示優勢菌相對豐度、細菌多樣性與土壤化學性質的關系。采用非度量多維度分析（NMDS，Non-metric multidimensional scaling）揭示不同處理細菌群落組成的差異，并用相似性分析[22]（ANOSIM，Analysis of similarities）判斷差異是否達到顯著水平（<0.05）。采用多元回歸樹分析[23]（MRT，Multivariate regression tree）研究細菌群落與土壤化學性質的關系。采用STAMP分析[24]（Statistical analysis of metagenomic profiles）揭示不同處理之間的顯著差異物種。單因素方差分析、Duncan多重比較、逐步回歸分析使用PASW Statistics 18.0完成，NMDS和ANOSIM分析使用R軟件（Version 3.4.4）的vegan包完成，MRT分析使用R軟件（Version 2.7.2）的mvpart包完成，STAMP分析使用STAMP軟件完成。Origin 8.5作圖。

2 結 果

2.1 土壤化學性質

經過25 a長期不同施肥，旱地紅壤的化學性質發生了顯著變化（表1）。N和NPK處理的土壤pH分別降低至4.02和4.15，而NPKM處理的土壤pH升高至5.99。NPK和NPKM處理均在不同程度上改善了土壤的肥力狀況。與CK相比，NPK處理使土壤SOC、TN、TP和AN均顯著提高（<0.05），分別提高了0.54倍、0.44倍、1.50倍和0.70倍，而NPKM處理對上述指標的提高幅度更大，分別達到1.11倍、1.18倍、3.65倍和1.19倍（<0.05）。土壤AP和AK對施肥的響應更加敏感，NPK處理的AP和AK相對于CK分別增加了22.4倍和3.71倍，而NPKM處理則分別增加55.5倍和9.00倍。然而，N處理對土壤肥力的改善效果微弱，僅TN相對于CK顯著增加。

表1 長期不同施肥對土壤化學性質的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。下同。Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between treatments at<0.05. The same below.

2.2 土壤細菌群落組成

對所有土壤樣品進行MiSeq高通量測序，經數據分析與優化篩選后共獲得了796 528條優質序列，其中最少序列的樣品為40 979條，最多序列的樣品為55 621條，樣品的平均序列數為49 783條。為使所有樣品的序列數在同一水平上進行比較，本研究中每個樣品隨機抽取40 000條序列用于分析，抽取后這些序列的96.6%可被歸類為細菌。

長期不同施肥顯著影響旱地紅壤門水平優勢菌的相對豐度（表2）。可以看出，與CK相比，所有施肥處理均顯著降低酸桿菌和芽單胞菌的相對豐度；NPK和NPKM處理顯著增加變形菌和厚壁菌的相對豐度，但卻顯著較低了藍細菌的相對豐度，而N處理對上述三種優勢菌的影響完全相反。此外，N和NPK處理顯著增加浮霉菌的相對豐度，顯著降低擬桿菌的相對豐度；而NPKM處理卻顯著增加擬桿菌的相對豐度，并顯著降低綠彎菌和放線菌的相對豐度。可見，土壤優勢菌對不同施肥的響應差異明顯。對OTU數據進行NMDS分析發現（圖1），各處理樣點在NMDS圖上分異明顯，互不交叉。經ANOSIM檢驗，任意兩處理之間的差異性均>0.90、<0.05，表明長期不同施肥已顯著改變土壤細菌群落組成。

2.3 土壤細菌多樣性

長期不同施肥顯著影響旱地紅壤細菌多樣性（表3）。與CK相比，N處理顯著降低土壤細菌多樣性，其物種豐富度、Chao1指數、系統發育多樣性和香農指數的降幅分別達到49.4%、46.7%、40.7%和21.4%；NPK處理也會顯著降低系統發育多樣性和香農指數，其降幅分別達到10.3%和13.0%；而NPKM處理可顯著提高物種豐富度、Chao1指數、系統發育多樣性和香農指數，其增幅分別達到63.2%、66.9%、41.1%和7.0%。

圖1 細菌群落組成的NMDS分析

2.4 土壤細菌群落特征與土壤化學性質的關系

逐步回歸分析發現（表4），9種土壤優勢菌中有6種（酸桿菌、綠彎菌、放線菌、浮霉菌、擬桿菌和芽單胞菌）的相對豐度均首先取決于土壤pH，厚壁菌的相對豐度也受土壤pH的影響，僅變形菌和藍細菌的相對豐度與土壤pH無關。同樣，土壤pH也是決定物種豐富度、Chao1指數、系統發育多樣性和香農指數的首要因素。土壤肥力狀況（TN、AN、AP等）對土壤優勢菌相對豐度和細菌多樣性的影響相對較弱。

進一步通過MRT分析發現，MRT共解釋了83.1%的細菌群落變異（圖2）。首先，細菌群落由土壤pH分為兩支，當pH≥4.73時CK和NPKM處理分在一支，當pH<4.73時N和NPK處理分在一支，此時pH的解釋率為46.3%。進一步地，pH又分別在5.64時和4.09時將CK和NPKM處理、N和NPK處理相互分開，pH的解釋率分別為22.4%和14.4%。可見，長期不同施肥后旱地紅壤細菌群落變化主要由土壤pH驅動。

表2 長期不同施肥對土壤優勢菌相對豐度的影響

表3 長期不同施肥對土壤細菌多樣性的影響

表4 優勢菌相對豐度、細菌多樣性與土壤化學性質的逐步回歸分析

注：NS表示沒有與因變量具有顯著相關性的自變量。Note：NS indicates no independent variable that has significant correlation with dependent variable.

圖2 不同處理土壤細菌群落的多元回歸樹分析

2.5 顯著差異物種

在細菌屬水平上進行STAMP分析發現（圖3），N、NPK和NPKM處理相對于CK分別有11、14和8個顯著差異細菌屬。與CK相比，N和NPK處理均顯著降低了和，顯著增加了，而NPKM處理的表現則完全相反。N和NPK處理均顯著增加了、和，而N、NPK和NPKM處理均會造成、和的顯著降低。

3 討 論

近幾十年來中國農田的土壤酸化現象引起了廣泛關注。Guo等[25]通過大范圍的調查發現，相比1980s，中國大部分農田的土壤pH在2000s時均顯著降低（<0.05）。化學氮肥的大量投入是造成土壤酸化的主要原因。高溫多雨的氣候特征使得南方紅壤本身就經歷緩慢的“自然酸化”過程，土壤呈酸性、鹽基離子大量淋失、有機質含量低，因而更易遭受由施肥引起的“人為酸化”的影響[2]。本研究也證實，長期施用化學氮肥急劇加速了紅壤的酸化進程，N和NPK處理的土壤pH分別下降至4.02和4.15。土壤在不同的酸化階段，會經歷不同元素的緩沖體系，尤其是當pH<4.2時，土壤進入Al緩沖體系使得大量的Al3+被釋放出來[26]。因此，N和NPK處理的地上植物和地下微生物可能已遭受Al毒的危害。而在相同施氮量的基礎上，用有機氮肥替代70%的化學氮肥則具有良好的改酸效果。有機肥的堿度、有機氮的氨化作用和有機陰離子的脫羧反應是減輕土壤酸度的主要原因[2]。并且，化肥有機肥配施（NPKM處理）也是改善土壤肥力的有效措施，其效果要明顯優于NPK處理，而單施氮肥（N處理）不利于土壤肥力的提升。

紅壤本身呈酸性，長期自然選擇的結果使嗜酸性的酸桿菌具有較高比重。然而經過25 a施肥，NPK和NPKM處理中酸桿菌相對豐度均顯著降低，變形菌成為最優勢種群，其原因既與土壤pH變化有關，也因為酸桿菌屬于典型的貧營養型（即K策略者）細菌[27]，大量投入的營養物質會抑制其生長，而變形菌屬于富營養型（即r策略者）細菌[28]，土壤肥力提升會促進其生長。Sun等[13]研究發現變形菌的相對豐度與土壤碳含量顯著正相關，本研究也證實土壤SOC是影響變形菌相對豐度的首要因素（表4）。綠彎菌和放線菌對有機肥施用非常敏感[29]，Tian等[30]甚至發現其相對豐度與有機肥的施用量呈負相關關系，本研究也發現NPKM處理顯著降低了綠彎菌和放線菌的相對豐度。但擬桿菌和厚壁菌不同，Chaudhry等[31]發現施用有機肥有利于提升其相對豐度，這與本研究結果一致。需要注意的是，與CK相比，NPKM處理中厚壁菌的相對豐度大幅提升了345.9%，且土壤AP的影響居首（表4），Yang等[32]研究也有相似結果。本研究中，長期單施氮肥僅提高土壤TN含量，未從根本上改善土壤肥力狀況，但也造成了貧營養型的酸桿菌、富營養型的變形菌以及其他一些菌群相對豐度降低，其原因可能是嚴重的土壤酸化（N處理土壤pH僅為4.02）對這些微生物產生了強烈的環境脅迫；同樣，擬桿菌通常也被認為是富營養型微生物[28]，但其相對豐度在NPK處理中顯著降低，也是因為土壤pH的脅迫作用超過了肥力改善的促進作用（表4）。

每一種微生物都具有獨特的生態位和特殊的生態功能，不同施肥措施造成的顯著差異微生物可以表征特殊的環境條件，因此具有很強的指示作用。Ward等[33]發現具有降解土壤中復雜有機化合物的能力，Yu等[34]發現長期秸稈還田顯著增加了紅壤水稻土中的相對豐度，本研究則證實長期施用豬糞也會增加旱地紅壤中的比例，而施用化肥的作用相反，并且受施N、NPK和NPKM的影響效應分別居各處理所有顯著差異細菌屬的第2、1、1位，因此它有可能作為評價土壤改良效果的敏感微生物指標。、和均屬于變形菌，其生態功能與土壤中的氮素固定或轉化密切相關，本研究發現N和NPK處理顯著增加了他們的相對豐度，但NPKM處理未表現出相似效果，這可能與它們偏好化學氮肥施用后的酸性土壤環境有關[35]，也可能是因為NPKM處理的土壤氮素水平最高限制了它們的生態功能發揮[36]。屬于變形菌，和屬于放線菌，各施肥處理均造成它們的相對豐度降低，表明它們對施肥極其敏感，相關性分析發現它們的相對豐度與TN、AN等土壤養分指標呈（極）顯著的負相關關系。

圖3 基于STAMP分析的顯著差異細菌屬

Sun等[13]發現，長期施用豬糞或牛糞有利于維持砂姜黑土的細菌群落組成。本研究也發現，盡管長期不同施肥使旱地紅壤的細菌群落發生轉變，但CK和NPKM處理仍更相似，N和NPK處理更相似（圖2），并且土壤pH是造成這種結果的唯一原因，即兩處理細菌群落相似是因為它們具有相近的土壤pH[13]。生物多樣性是生態系統穩定的基礎，土壤微生物多樣性是土壤質量和健康的標志。本研究證明施用有機肥提高了土壤細菌多樣性，而單施氮肥會導致其大幅降低。尤其需要注意的是，長期施用化肥氮磷鉀也會降低土壤細菌多樣性，而“重化肥輕有機肥”正是近幾十年來我國農業生產中的普遍現象。土壤細菌多樣性的降低，意味著土壤微生物生態功能的缺失，長期發展下去勢必會影響生態系統的穩定性和生產力。逐步回歸分析發現（表4），決定細菌多樣性的首要因素也是土壤pH。

由上述分析可以看出，經過25 a的長期施肥，雖然NPK和NPKM處理顯著改善了旱地紅壤的土壤肥力，尤其是土壤的速效養分含量（如AP）得到極大提升，但影響土壤優勢菌相對豐度、細菌群落組成和多樣性的首要因素仍是土壤pH，這與許多研究[7-10]認為是施肥造成的養分變化直接驅動了微生物群落轉變的觀點不同。造成這種不一致的主要原因是土壤pH的變化幅度，Xun等[37]提出了“橄欖球模型”來解釋這種現象：即土壤在近中性環境（以橄欖球的中部表征），土壤養分對細菌群落的轉變有較強的驅動作用（橄欖球中部的橫截面半徑較大，以此表征養分指標驅動作用的強度和方向），隨著土壤酸化或堿化的加劇（以橄欖球的兩端表征），土壤pH對細菌群落轉變的影響越來越大，而土壤養分的作用被逐漸限制（趨向兩端，橄欖球橫截面的半徑縮小）。在本研究中，不同施肥使得旱地紅壤pH發生了顯著變化，尤其是長期單施化肥急劇加速了土壤酸化，土壤甚至已經進入到危害嚴重的Al緩沖體系，土壤酸化的負面效應已遠超肥力改善的正面效應。而化肥有機肥配施在補充土壤養分的同時，也明顯改善了土壤酸度，更促進了土壤養分正面效應的充分發揮。

本研究側重考察了長期施肥對旱地紅壤細菌群落組成和多樣性的影響，這對于評估生態系統的穩定性具有指導意義，但就土壤生態功能發揮而言，土壤微生物的數量及活性等也至關重要，這有待將來進一步研究完善。此外，細菌雖然是土壤中種類最多、數量最大且目前研究最廣泛的一類微生物，但也不能忽視土壤中其他重要的微生物類群（如古菌、真菌等）以及具有特殊功能的微生物類群（如固氮菌、硝化細菌、解磷菌等），將來也有必要利用高通量測序技術研究它們對長期施肥的響應，這樣才能更全面、真實地了解施肥措施對旱地紅壤生態系統的影響。

4 結 論

長期施用化肥嚴重加劇旱地紅壤酸化，化肥有機肥配施不僅大幅降低土壤酸度，而且對土壤肥力的改善效果最好。不同施肥措施使旱地紅壤細菌群落發生顯著變化，長期施用化肥降低了土壤細菌多樣性，而化肥有機肥配施明顯提高細菌多樣性。經分析確定，土壤pH是影響旱地紅壤細菌群落的關鍵因素，土壤肥力的作用相對較弱，長期施用化學氮肥造成的紅壤酸化的負面效應已遠超肥力改善的正面效應。因此，旱地紅壤施肥應以防治土壤酸化為前提，化肥有機肥配施是一項適宜的施肥措施。

［1］ Huang G Q，Zhao Q G. Initial exploration of red soil ecology. Acta Ecologica Sinica，2014，34（18）：5173—5181. [黃國勤，趙其國. 紅壤生態學. 生態學報，2014，34（18）：5173—5181.]

［2］ Liu J，Liu M，Wu M，et al. Soil pH rather than nutrients drive changes in microbial community following long-term fertilization in acidic Ultisols of Southern China. Journal of Soils and Sediments，2018，18（5）：1853—1864.

［3］ Xin X L，Qin S W，Zhang J B，et al. Yield，phosphorus use efficiency and balance response to substituting long-term chemical fertilizer use with organic manure in a wheat-maize system. Field Crops Research，2017，208：27—33.

［4］ Duan Y H，Xu M G，Gao S D，et al. Nitrogen use efficiency in a wheat–corn cropping system from 15 years of manure and fertilizer applications. Field Crops Research，2014，157：47—56.

［5］ Liu J，Chen J R，Xie J，et al. Effects of nitrogen application time on biomass and nitrogen accumulation of peanut in upland red soil. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2017，39（4）：515—523. [劉佳，陳靜蕊，謝杰，等. 不同施氮時期對紅壤旱地花生生物量和氮素累積的影響. 中國油料作物學報，2017，39（4）：515—523.]

［6］ Ku?lien? G，Rasmussen J，Kuzyakov Y，et al. Medium-term response of microbial community to rhizodeposits of white clover and ryegrass and tracing of active processes induced by13C and15N labelled exudates. Soil Biology& Biochemistry，2014，76：22—33.

［7］ Chen X F，Li Z P，Liu M，et al. Microbial community and functional diversity associated with different aggregate fractions of a paddy soil fertilized with organic manure and/or NPK fertilizer for 20 years. Journal of Soils and Sediments，2015，15（2）：292—301.

［8］ Xia X，Shi K，Huang Q R，et al. The changes of microbial community structure in red paddy soil under long-term fertilization. Acta Pedologica Sinica，2015，52（3）：697—705. [夏昕，石坤，黃欠如，等. 長期不同施肥條件下紅壤性水稻土微生物群落結構的變化. 土壤學報，2015，52（3）：697—705.]

［9］ Zhang Q，Zhou W，Liang G Q，et al. Distribution of soil nutrients，extracellular enzyme activities and microbial communities across particle-size fractions in a long-term fertilizer experiment. Applied Soil Ecology，2015，94：59—71.

［10］ Zhong W H，Gu T，Wang W，et al. The effects of mineral fertilizer and organic manure on soil microbial community and diversity. Plant and Soil，2010，326（1/2）：511—522.

［11］ Xun W B，Zhao J，Xue C，et al. Significant alteration of soil bacterial communities and organic carbon decomposition by different long-term fertilization management conditions of extremely low-productivity arable soil in South China. Environmental Microbiology，2016，18（6）：1907—1917.

［12］ Zeng J，Liu X J，Song L，et al. Nitrogen fertilization directly affects soil bacterial diversity and indirectly affects bacterial community composition. Soil Biology & Biochemistry，2016，92：41—49.

［13］ Sun R B，Zhang X X，Guo X S，et al. Bacterial diversity in soils subjected to long-term chemical fertilization can be more stably maintained with the addition of livestock manure than wheat straw. Soil Biology & Biochemistry，2015，88：9—18.

［14］ Ma X Y，Liu M，Li Z P. Shifts in microbial biomass and community composition in subtropical paddy soils under a gradient of manure amendment. Biology and Fertility of Soils，2016，52（6）：775—787.

［15］ Xia W W，Jia Z J. Comparative analysis of soil microbial communities by pyrosequencing and DGGE. Acta Microbiologica Sinica，2014，54（12）：1489-1499. [夏圍圍，賈仲君. 高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價. 微生物學報，2014，54（12）：1489—1499.]

［16］ Liu K L，Huang J，Zhang H M，et al. Effect of long-term fertilization on aggregation characteristics and distribution of potassium fractions in red soil. Acta Pedologica Sinica，2018，55（2）：443—454. [柳開樓，黃晶，張會民，等. 長期施肥對紅壤旱地團聚體特性及不同組分鉀素分配的影響. 土壤學報，2018，55（2）：443—454.]

［17］ Cai Z J，Wang B R，Xu M G，et al. Intensified soil acidification from chemical N fertilization and prevention by manure in an 18-year field experiment in the red soil of Southern China. Journal of Soils and Sediments，2015，15（2）：260—270.

［18］ Lu R K. Analytical methods for soil and agro-chemistry. Beijing：China Agricultural Science and Technology Press，2000. [魯如坤. 土壤農業化學分析方法. 北京：中國農業科技出版社，2000.]

［19］ Biddle J F，Fitz-Gibbon S，Schuster S C，et al. Metagenomic signatures of theMargin subseafloor biosphere show a genetically distinct environment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（30）：10583—10588.

［20］ Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods，2010，7（5）：335—336.

［21］ Sun R B，Guo X S，Wang D Z，et al. The impact of long-term application of chemical fertilizers and straw returning on soil bacterial community. Microbiology China，2015，42（10）：2049—2057. [孫瑞波，郭熙盛，王道中，等. 長期施用化肥及秸稈還田對砂姜黑土細菌群落的影響. 微生物學通報，2015，42（10）：2049—2057.]

［22］ Clarke K R. Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. Austral Ecology，1993，18（1）：117—143.

［23］ De’Ath G. Multivariate regression trees：A new technique for modeling species–environment relationships. Ecology，2002，83（4）：1105—1117.

［24］ Parks D H，Tyson G W，Hugenholtz P，et al. STAMP：Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics，2014，30（21）：3123—3124.

［25］ Guo J H，Liu X J，Zhang Y，et al. Significant acidification in major Chinese croplands. Science，2010，327（5968）：1008—1010.

［26］ Ulrich B. Natural and anthropogenic components of soil acidification. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，1986，149（6）：702—717.

［27］ Fierer N，Lauber C L，Ramirez K S，et al. Comparative metagenomic，phylogenetic and physiological analyses of soil microbial communities across nitrogen gradients. The ISME Journal，2012，6（5）：1007—1017.

［28］ Fierer N，Bradford M A，Jackson R B. Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology，2007，88（6）：1354—1364.

［29］ Sun J，Zhang Q，Zhou J，et al. Pyrosequencing technology reveals the impact of different manure doses on the bacterial community in apple rhizosphere soil. Applied Soil Ecology，2014，78：28—36.

［30］ Tian W，Zhang Z H，Hu X F，et al. Short-term changes in total heavy metal concentration and bacterial community composition after replicated and heavy application of pig manure-based compost in an organic vegetable production system. Biology and Fertility of Soils，2015，51（5）：593—603.

［31］ Chaudhry V，Rehman A，Mishra A，et al. Changes in bacterial community structure of agricultural land due to long-term organic and chemical amendments. Microbial Ecology，2012，64（2）：450—460.

［32］ Yang Y R，Li X G，Liu J G，et al. Bacterial diversity as affected by application of manure in red soils of subtropical China. Biology and Fertility of Soils，2017，53（6）：639—649.

［33］ Ward N L，Challacombe J F，Janssen P H，et al. Three genomes from the Phylum acidobacteria provide insight into the lifestyles of these microorganisms in soils. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（7）：2046—2056.

［34］ Yu Y J，Wu M，Petropoulos E，et al. Responses of paddy soil bacterial community assembly to different long-term fertilizations in southeast China. Science of the Total Environment，2019，656：625—633.

［35］ van den Heuvel R N，van der Biezen E，Jetten M S M，et al. Denitrification at pH 4 by a soil-derived-dominated community. Environmental Microbiology，2010，12（12）：3264—3271.

［36］Ikeda S，Sasaki K，Okubo T，et al. Low nitrogen fertilization adapts rice root microbiome to low nutrient environment by changing biogeochemical functions. Microbes and Environments，2014，29（1）：50—59.

［37］ Xun W B，Huang T，Zhao J，et al. Environmental conditions rather than microbial inoculum composition determine the bacterial composition，microbial biomass and enzymatic activity of reconstructed soil microbial communities. Soil Biology & Biochemistry，2015，90：10—18.

Effects of Long-Term Fertilization on Bacterial Community in Upland Red Soil

LIU Jia1, 2, 3, CHEN Xiaofen1, 2, 3, LIU Ming1, WU Meng1, WANG Boren4, 5, CAI Zejiang4, 5, ZHANG Taolin1, 2, LI Zhongpei1, 2?

(1. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Soil and Fertilizer & Resources and Environment Institute,Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, National Engineering & Technology Research Center for Red Soil Improvement, Nanchang 330200, China; 4.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 5. National Observation Station of Qiyang Agro-ecology System, Qiyang,Hunan 426182,China)

Fertilization is an effective measure to improve soil fertility and increase crop yield in red soil. As important components of a soil ecosystem, soil microorganisms play an essential role in soil fertility formation, organic matter decomposition, and nutrient biogeochemical recycling as well. However, though soil microorganisms are very sensitive to fertilization, limited information is available in the literature about effects of fertilization on the microbial community in upland red soil. The objective of this study is to investigate responses of the bacterial community in upland red soil to long-term fertilization varying in strategy, and to provide a theoretical basis for rational fertilization and sustainable utilization of the red soil in South China.In this study, a long-term field fertilization experiment (established in 1990) on winter wheat–summer maize rotation at the Qiyang Red Soil Experimental Station of the Chinese Academy of Agricultural Sciences was carried out.The experiment had four treatments, i.e. no fertilizer (CK), only application of chemical nitrogen fertilizer (N), application of chemical nitrogen, phosphorus and potassium fertilizer (NPK), and application of NPK plus manure (NPKM). Except CK, all the treatments

N 300 kg·hm–2·a–1, and the N in Treatment NPKM had 30% coming from chemical fertilizer and the rest from manure. Samples of surface soil (0～20 cm) were collected in May 2015 (after wheat was harvested and before maize was planted). The technology of high-throughput sequencing of the V4-V5 16S rRNA gene region were used to determine composition and diversity of the soil bacterial community in the samples, and then to identify key factors affecting the bacterial community in the upland red soil.Results show: (1) Long-term fertilization significantly changed chemical properties of the upland red soil. Compared with CK, Treatments N and NPK declined significantly or down to 4.02 and 4.15, respectively, in soil pH, while Treatment NPKM increased significantly or up to 5. 99. Both NPK and NPKM significantly improved soil fertility, but the effect of the latter was much better than the former. However, Treatment N only increased soil TN content, which was not conducive to soil fertility; (2) Long-term fertilization affected relative abundance of the soil dominant bacteria at the phylum level. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) and similarity analysis (ANOSIM) shows that soil bacterial communities in the treatments varied significantly; (3) Compared with CK, Treatment N was 21.4%～49.4% lower in the four diversity indices (observed species, Chao1 index, phylogenetic diversity and Shannon index), while Treatment NPKM was 7.0%～66.9% higher. Besides, Treatment NPK was 10.3% and 13.0% lower, respectively in phylogenetic diversity and Shannon index; (4) Stepwise regression analysis shows that soil pH was the primary factor determining relative abundance of the dominant soil bacterial phyla and four diversity indices of the soil bacterial community. Furthermore, multivariate regression tree (MRT) analysis shows that soil pH explained 83.1% of the detected variation of the soil bacterial communities between the treatments, and differentiation of the bacterial community was driven by soil pH; and (5) Compared with CK, statistical analysis of metagenomic profiles (STAMP) shows that Treatment N, NPK and NPKM had 11, 14 and 8 treatment-specific bacterial genera, respectively.In conclusion, the bacterial community in the upland red soil following long-term fertilization is mainly affected by soil pH, and the negative effects of soil acidification induced by long-term fertilization may have far exceeded the positive effects of fertility improvement. Therefore, fertilization in upland red soil should be based on the premise of prevention of soil acidification, and combined application of chemical fertilizer and manure is a suitable fertilization measure.

Long-term fertilization; Upland red soil; Bacterial community; High-throughput sequencing; Soil pH

S154.3

A

10.11766/trxb201810090507

劉佳，陳曉芬，劉明，吳萌，王伯仁，蔡澤江，張桃林，李忠佩. 長期施肥對旱地紅壤細菌群落的影響[J]. 土壤學報，2020，57（2）：468–478.

LIU Jia，CHEN Xiaofen，LIU Ming，WU Meng，WANG Boren，CAI Zejiang，ZHANG Taolin，LI Zhongpei. Effects of Long-Term Fertilization on Bacterial Community in Upland Red Soil[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（2）：468–478.

* 國家自然科學基金項目（41661052，31660599）、國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2014CB441003）和“一三五”計劃和領域前沿項目（ISSASIP1642）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos. 41661052 and 31660599），the National Basic Research Program（973 Program）of China（No. 2014CB441003）and the “135”Plan and Field Frontier Project（No. ISSASIP1642）

，E-mail：zhpli@issas.ac.cn

劉 佳（1984—），男，安徽六安人，博士研究生，主要從事紅壤酸化及有機質轉化研究。E-mail：liujia422@126.com

2018–10–09；

2019–01–20；

優先數字出版日期（www.cnki.net）：2019–02–26

（責任編輯：盧 萍）