添加糖蜜對油莎草青貯發酵品質及黃酮的影響

靳思玉，王立超，李苗苗，張嘉賓，王健，張愛忠，曹陽,3

（1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶，163000；2.黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室，黑龍江 大慶，163000；3.畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，哈爾濱150030）

0 引 言

油莎草（Cyperusesculentus L）為莎草科多年生草本植物，原產于地中海，于上個世紀五十年代引入我國[1]。油莎草耐旱耐澇，對土質要求不高，除蝗蟲以外無其他病蟲害。分蘗速度快，產量高且穩定。地下塊莖部分油脂含量高，做榨油使用。莖葉的油脂含量低，不作為深加工的原料，一般制成干草直接飼喂家畜，或是棄于田間直接焚燒，不僅破壞環境還造成資源浪費[2]。目前畜牧業上對油莎草的認知度并不夠，尤其缺乏對油莎草作為飼料貯藏加工方面的研究。

《名醫別錄》中記載油莎草莖葉具有行氣止痛、疏肝解郁、主胸悶不舒、風疹瘙癢和癰伴隨腫毒等功效。研究表明黃酮是油莎草莖葉部分主要活性物質，其主要功能就是抗炎消毒、抗腫瘤和清除自由基等作用[3]。如果可以在畜牧行業加以利用，不僅在一定程度上可以代替抗生素，還具有保護動物健康的作用。研究表明，青綠牧草在加工干草的過程中，黃酮等功能性成分提取量較低[4]。青貯加工不僅可以保持牧草青綠多汁的特性，減少牧草中營養物質損失，還可以最大程度保留牧草中生物活性物質[5]。而溫度對青貯發酵品質有著重要影響，低溫環境會降低青貯發酵過程中乳酸菌等有益菌的活性，抑制其生長，從而降低發酵品質[6]。低溫影響著高寒地區低溫季節對青貯飼料的利用，目前低溫青貯飼料技術的研究報道并不多，在低溫條件下提高青貯發酵品質，降低發酵腐敗幾率，可以促進高寒地區對青綠飼料資源開發與利用，對緩解高寒地區在低溫季節飼料短缺問題具有重要意義。

糖蜜是制糖工業的副產品，含有許多糖類物質和營養成分[7]。Cao[8]等在添加糖蜜對全麥全混合日糧青貯飼料發酵品質及體外干物質消失率影響的研究中發現，添加糖蜜可以提高青貯發酵品質和體外干物質消失率。本研究通過分析在不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯的一般化學成分、黃酮含量、發酵品質、微生物組成以及體外消化影響，探索油莎草青貯飼料在不同溫度下調制加工技術，為其作為草食動物飼料資源提供數據參考以及和理論依據。

1 材 料

1.1 油莎草及添加劑

油莎草采自大慶市杜爾伯特草原，于通風處晾至半干（含水量65%左右），切短至2-3 cm。糖蜜購自成都金糖蜜商貿有限公司，總糖（蔗糖+還原糖）≥40%，°Bé≥33.333。

1.2 培養基制備

配制MRS 瓊脂培養基（De Man，Rogosa and Sharpe Agar，MRS，培養乳酸菌）、藍色瓊脂培養基（Blue Light Broth Agar，BLB，培養大腸桿菌）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Aextrose Agar，PDA，培養酵母菌和霉菌）、營養瓊脂培養基（Nutrient Agar，NA，培養好氧菌和耐熱菌）、梭菌計數瓊脂培養基（Clos?tridial Count Agar，CCA，培養丁酸菌）培養基備用。配制好的培養基需要用滅菌鍋滅菌（121 ℃，20 min），每個培養皿倒入20 mL 左右。培養板凝固后放入37 ℃恒溫培養箱中，12 h 后查看是否有污染，若有污染棄用。

1.3 主要儀器

真空包裝機（AT-620），北京吉奧德包裝機械有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋（GR85DF），廈門致微儀器有限公司；生物潔凈工作臺（BCN-1360B），北京東聯哈爾儀器制造有限公司；pH 值計（FE20-K），梅特勒托利多國際貿易（上海）有限公司；高速冷凍離心機（1-14K），上海珂淮儀器有限公司；高效氣象色譜儀（GC-2010），島津企業管理（中國）有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DGG-9070B），電熱恒溫水浴槽（DK-80），電熱恒溫培養箱（DRP-9082），均購自上海森信實驗儀器有限公司；微型植物粉碎機（FZ-102），山西太原騰達科學器材有限公司；電子天平（JD100-3B），沈陽龍騰電子有限公司；超純水機（XYE2-2--H）北京湘順源科技有限公司；厭氧培養箱（YQX-Ⅱ），上海新苗醫療器械制造有限公司；均質器（BAGMIXER?400W），上海巴玖實業有限公司；空氣浴振蕩器（HZQ-C），哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；紫外可見分光光度計（UV-6100A），上海元析儀器有限公司；茂福爐（SRJX-8-13A），廣州航信科學儀器有限公司；凱氏定氮儀（K9840），廣州市科迅實驗器材有限公司；半自動纖維儀（A200i），合肥艾本森科學儀器有限公司。

2 方 法

2.1 試驗設計

試驗采用兩因素的試驗設計（添加2×溫度2），采用小規模青貯調制法，置于常溫（22±2 ℃）和低溫（4 ℃）下發酵35 d。試驗分為2 個處理組（每個處理三個重復），包括對照組（無添加）、糖蜜組（添加量4%，鮮物質基礎）。稱取處理好的樣品200 g 裝入規格為16×25 cm 聚乙烯袋中，真空密封包裝后放置常溫和4 ℃冰箱中保存。

2.2 感官品質評定

根據青貯質量評定標準的說明[9]，油莎草青貯開封后對其顏色、氣味、質地以及有無霉變這四個方面進行品質評定。

2.3 一般化學成分分析

將開封后的樣品放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在65 ℃條件下烘至恒重，由此得出自由水含量。用微型植物粉碎機將樣品粉碎并過1 mm 篩后進行一般化學成分分析，測定項目包括干物質、有機物、粗脂肪、粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量。

有機物、粗蛋白、粗脂肪的測定分別用（AOAC）中的方法934.01、976.05、920.39 進行[10]中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維利用Van soest方法進行測定[11]。

2.4 黃酮含量測定

根據楊文菊、敬思群、楊潔[12]方法進行標準曲線建立和黃酮含量測定。

2.5 發酵品質測定

稱取開封后的原樣20 g 置于聚乙烯袋中，加入180 mL 滅菌蒸餾水，用均質器拍打90 s，用快速定性濾紙過濾測定pH 值。一部分濾液經12 000 r/min 離心5 min，并用0.22 μm 濾膜過濾后，采用氣相色譜儀進行乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分析。

色譜條件為：汽化室參數為載氣氮氣（N2），分流比40∶1，進樣量0.4 μL，溫度220 ℃；色譜柱參數為HP-IN?NOWax毛細管色譜柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均線速度38 cm/s；柱溫箱參數為程序升溫120 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min 上升至180 ℃保持1 min；檢測器參數為氫氣（H2）流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，柱流量+尾吹氣流量45 mL/min，火焰離子檢測器（FID）溫度250 ℃

根據馮宗慈、高民[13]的方法測定氨態氮。

2.6 微生物組成

將MRS、BLB、NA、PDA 培養基劃定1×10-1倍、1×10-3倍、1×10-5倍3個培養區域，其中CCA 和NA（耐熱）培養基劃定1×10-1倍和1×10-2倍2 個培養區域。用無菌水將聚乙烯袋內剩余的菌液進行梯度稀釋，連續稀釋為1×10-1、1×102、1×103、1×10-4及1×10-5倍液。用移液槍移取20 μL，按照培養基中預先劃分好的區域將稀釋液以先高倍后低倍的順序滴入培養基中，并用涂菌棒均勻涂開。將101和102稀釋液水浴加熱（75 ℃，15 min），快速冷卻后涂CCA、NA（耐熱）培養基。其中MRS、CCA 置于厭氧培養箱（37 ℃）培養，其余置于恒溫培養箱（37 ℃）培養48 h 后取出進行菌落數計數。

2.7 體外消化

使用兩頭安裝永久性瘤胃瘺管的雄性大尾寒羊，體重為37±5 kg（黑龍江八一農墾大學動物飼養實驗室），在早晨飼喂后2 h 從瘤胃瘺管抽取瘤胃液（所使用的所有工具必須提前預熱至39 ℃），用紗布過濾，通入CO2保持厭氧環境，并以人工唾液：瘤胃夜為4∶1比例均勻混合。人工唾液按照Mc Dougll’s buffer 方法[14]（每1 000 mL 含有氯化鉀0.57 g、碳酸氫鈉9.80 g、氯化鈣0.04 g、十二水磷酸氫二鈉9.30 g、氯化鎂0.06 g、氯化鈉0.47 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g、刃天青鈉鹽0.01 g 配制。用天平準確稱取開封后粉碎的青貯0.50 g（干物質基礎）提前裝入容量為125 mL 的血清瓶，注入50 mL 混合培養液，迅速封好瓶口，置于39 ℃，100 r/min 的空氣浴振蕩器，培養48 h。培養結束后將血清瓶放入冰水中停止發酵，這時開始進行pH 值、干物質消失率、產氣量進行測定。

經快速定性濾紙過濾后的培養液10 mL 移到離心試管，經高速冷凍離心機2 200 r/min 離心5 min，上清液移出備用。取出上清液1 mL，加等量的10%偏磷酸溶液（偏磷酸溶解于1 mol/L 硫酸溶液，10%w/v），充分混合（除蛋白）。再經高速冷凍離心機6 000 r/min 離心30 min，得上清液。上清液取0.5 mL，加入標準品20 mmol/L 的丁烯酸0.5 mL 充分混合。混合液的丁烯酸濃度為10 mmol/L（與標準液濃度相同）。再將混合液中加入純磷酸0.01 mL 充分混合（調整為酸性），將混合后的溶液4 ℃放置一個晚上。放置后的液體，經高速冷凍離心機6 000 r/min 離心30 min，取上清液，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾后，用高效氣相色譜儀分析乙酸、丙酸、丁酸含量（色譜條件同上）。

2.8 統計分析

本實驗使用SAS 9.2 統計學軟件，對差異顯著項目進行多重比較，并采用Tukey 檢驗用于比較平均數之間的差異顯著性（P＜0.05）。

3 試驗結果

3.1 感官品質

結果見表1。由表1 可知，在常溫條件下，青貯后的油莎草均為黃綠色，糖蜜組的酸香味濃于對照組，質地柔軟且水分適宜，無霉變；在低溫條件下，糖蜜組比對照組黃，且酸香味濃于對照組，質地柔軟且水分適宜，無霉變。

表1 不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯感官品質的影響

表2 不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯一般化學成分的影響

3.2 化學成分分析

結果如表2 所示，在添加處理組中，干物質、有機物和酸性洗滌纖維含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），粗蛋白、粗脂肪和中性洗滌纖維含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；在溫度處理組中，干物質、粗脂肪、有機物和酸性洗滌纖維含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），粗蛋白和中性洗滌纖維含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；在添加和溫度處理交互作用下，干物質、有機物和酸性洗滌纖維含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），粗蛋白、粗脂肪和中性洗滌纖維含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

3.3 黃酮含量

結果如表3 所示，在添加處理組、溫度處理組、添加和溫度處理交互作用下黃酮含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

3.4 發酵品質

結果如表4 所示，在添加處理組中，pH 值、乳酸和氨態氮/總氮與對照組相比差異顯著（P＜0.05），乙酸、丙酸和丁酸含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；在溫度處理組中，pH 值和氨態氮/總氮與對照組相比差異顯著（P＜0.05），乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；在添加和溫度處理交互作用下，pH 值、乳酸和氨態氮/總氮與對照組相比差異顯著（P＜0.05），乙酸、丙酸和丁酸含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯黃酮含量的影響

3.5 微生物組成

結果如表5 所示，在添加處理組中，乳酸菌、耐熱菌、一般細菌和酵母菌數量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；在溫度處理組中，乳酸菌、一般細菌和酵母菌數量與對照組相比差異顯著（P＜0.05），耐熱菌數量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；在添加和溫度處理交互作用下，乳酸菌、耐熱菌、一般細菌和酵母菌數量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；各處理組中均未檢出大腸桿菌、丁酸菌和霉菌。

3.6 干物質消失率和揮發性脂肪酸

結果如表6 所示，在添加處理組中，干物質消失率、pH 值、乙酸、丙酸和氨態氮含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），產氣量和丁酸含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；在溫度處理組中，干物質消失率、pH 值、產氣量、乙酸、丙酸、和丁酸含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），氨態氮含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；在添加和溫度處理交互作用下，干物質消失率、pH 值、乙酸、丙酸和氨態氮含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），產氣量和丁酸含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

4 討 論

經過發酵處理后的飼料質地柔軟，水分適宜，并且有濃厚酸味[15]。經過35 d 的青貯后，油莎草青貯均未發現霉變，主要呈現為黃綠色，質地柔軟，不粘手，水分適宜，這與劉輝[16]等研究結果相同。在低溫條件下發酵的對照組還呈草綠色，具有草香味，說明低溫對照組在發酵35 d 時還未進入發酵穩定期，在低溫條件下青貯發酵速度遠遠低于常溫條件[17]。

表4 不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯發酵品質的影響

表5 不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯微生物的影響

表6 不同溫度下添加糖蜜對油莎草青貯干物質消失率及揮發性脂肪酸的影響

青貯飼料中粗蛋白被降解成氨態氮，降低有機物含量，造成一些營養損失[18]，這與本研究結果一致。青貯飼料中的氨態氮/總氮反應了青貯過程中粗蛋白的分解程度，氨態氮/總氮愈大時，表明粗蛋白分解越多，青貯飼料的發酵品質越低[18]。在本實驗中，糖蜜組氨態氮/總氮顯著低于對照組（P＜0.05），粗蛋白含量顯著高于對照組（P＜0.05），說明添加糖蜜降低蛋白質水解程度。在青貯發酵的0～7 d 蛋白水解酶活性比較強，蛋白快速被水解，但在發酵后期蛋白水解酶活性逐漸下降蛋白分解緩慢[20]。研究表明，蛋白水解酶的最適pH 值為6.8～9.8[21]。而在整個青貯發酵過程中由于乳酸含量在發酵前期快速上升，導致pH 值快速下降，而在發酵后期乳酸含量和pH 值變化趨于緩和。在本實驗中，糖蜜組的乳酸含量顯著高于對照組（P＜0.05），pH 值顯著低于對照組（P＜0.05）。由此我們推測pH 值的下降抑制了蛋白水解酶活性，導致糖蜜組氨態氮/總氮顯著低于對照組（P＜0.05），粗蛋白含量顯著高于對照組（P＜0.05），說明添加糖蜜降低蛋白質水解程度。Alli 等人評價了添加糖蜜對全株銀合歡青貯的影響，糖蜜以2.25%和4.5%的鮮物基礎進行添加，結果表明，添加組乳酸含量高于對照組，pH 值降低，減少干物質損失，氨態氮/總氮也低于對照組，這與本研究的結果一致。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量降低。這與顧擁建等[22]的研究結果相同。在低溫的條件下，糖蜜組的粗蛋白、粗脂肪含量略高于對照組，有機物、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維略低于對照組，這與劉秦華等[23]研究相同。糖蜜組的營養成分高于對照組，說明在低溫條件下添加糖蜜對營養成分的保存有一定的作用。

黃酮類化合物與植物細胞壁中的木質素結合在一起，青貯過程可以破壞植物細胞壁，使得更多的黃酮被釋放出來[24]。王洋[5]等在乳酸菌添加劑對苜蓿青貯黃酮含量影響的研究中發現，處理組黃酮含量顯著高于對照組（P＜0.05）。而發酵品質優良的青貯酸性洗滌纖維含量低于對照組，在本研究中，在常溫和低溫條件下糖蜜組黃酮提取量高于對照組。

乳酸含量高是發酵品質良好的典型特征[25]，在青貯飼料發酵過程中，乳酸菌可以有效利用可溶性碳水化合物產生乳酸，以降低pH 值，抑制有害微生物的生長繁殖，從而獲得品質良好的青貯飼料[26]。而青貯中添加糖蜜會為乳酸的生成，提供更多的發酵底物[8]。在本試驗中，在不同溫度條件下糖蜜組pH 值顯著低于對照組（P＜0.05），常溫條件下糖蜜組乳酸含量顯著高于對照組（P＜0.05），低溫條件下乳酸含量雖然與對照組差異不顯著，但高于對照組59.02%。

乳酸菌在青貯發酵中起重要作用，乳酸菌數量已成為預測青貯飼料發酵充分性的重要因素，通常，乳酸菌數量達到105（cfu/g FM）時，青貯飼料可以很好的保存[27]，在本實驗中，各處理組的乳酸菌數量均高于105（cfu/g FM），說明油莎草青貯發酵非常充分且保存完好。發酵是在厭氧環境下進行，隨著發酵過程中乳酸菌數量增加，使得其乳酸含量增加，隨著pH 值的降低，抑制有害微生物的生長和繁殖[28]。在本試驗中，常溫條件下乳酸菌數量顯著高于對照組（P＜0.05），耐熱菌、一般細菌和酵母菌顯著低于對照組（P＜0.05），這與Cao 等[29]研究結果相同。低溫會抑制微生物的生長，所以微生物數量都低于常溫，這與王鵬等[30]研究結果相同。在低溫條件下，糖蜜組的乳酸菌數量高于對照組12.85%，耐熱菌、一般細菌和酵母菌分別低于對照組8.38%、10.89%和12.89%。

瘤胃內的pH 值是衡量瘤胃微生物生態系統平衡的重要指標，也是建立平衡微生物種群的一個限制性因素[31]。瘤胃內pH 值與發酵產生的氣體成反比[32]，瘤胃內氨態氮是瘤胃微生物蛋白質合成的重要氮源[33]，瘤胃微生物蛋白和揮發性脂肪酸為反芻動物提供了大量的蛋白質和能量，此外，飼料中的多糖是瘤胃微生物的重要能量和碳源[34]。Yahaya 等[35]研究表明，隨著飼料的青貯時間延長纖維的消化率增加，提高青貯飼料的干物質消失率。在本試驗中，糖蜜組的干物質消失率顯著提高（P＜0.05），產氣量、乙酸、丙酸和丁酸高于對照組，這與Cao 等[36]人的研究結果一致。在瘤胃中丙酸和甲烷的產生都需要氫氣，因此，丙酸的形成可以被視為氫氣使用的競爭途徑[37]，當乳酸利用細菌在瘤胃中二次發酵時，通常會產生丙酸鹽[38]，這可以減少甲烷的產生。本研究結果顯示糖蜜組的丙酸含量高于對照組，說明添加糖蜜在一定程度上可以減少甲烷的產生。

5 結 論

在本試驗條件下添加糖蜜可以提高常溫和低溫條件下油莎草青貯的發酵品質和黃酮含量。