固相萃取小柱-超高效液相串聯質譜測定牛奶中氯霉素

馬曉年，梁志堅，李怡

（昆明市疾病預防控制中心,昆明650228）

0 引 言

牛奶中含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和礦物質等營養物質。2008 年1 月15 日，衛生部發布的《中國居民膳食指南(2007)》介紹了新版《膳食寶塔》凸顯牛奶價值，牛奶是攝取營養元素的催化劑以及健康的關鍵，是健康膳食的基石[1]。但由于奶牛飼養過程中，對泌乳期奶牛用藥不當、違反國家規定把抗生素作為奶牛飼料添加劑使用、未經徹底清洗和消毒患病奶牛使用過的擠奶工具及貯奶設備、高溫季節摻雜抗生素防止牛奶酸敗等原因，造成牛奶抗生素污染[2-3]。牛奶中的抗生素殘留主要以氯霉素為主，氯霉素(Chloram?phnicol，CAP)屬廣譜抗生素，能抑制細菌蛋白質的形成，廣泛用于動物各種傳染性疾病的治療，特別是用于奶牛乳腺炎的治療，從而易使奶及奶制品中存在氯霉素殘留。由于氯霉素可引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏癥等疾病[4]，1999 年9 月13 日中華人民共和國農業部發布了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[5]的通知，規定了氯霉素在所有食品動物的可食用組織不得檢出。

目前，氯霉素主要通過固相萃取小柱進行前處理的提取、凈化[6-7]，測定方法有液相色譜[8]、液相色譜-串聯質譜[9-15]。液相色譜采用保留時間定性，易出現假陽性，而液相色譜-串聯質譜采用核質比定性，具有更高的準確度。液相色譜-串聯質譜較于液相色譜具有更高的靈敏度，實現對痕量物質更低的檢出限。前處理部分，國標方法[11]采用C18 固相萃取小柱對牛奶進行提取、凈化，風險監測工作手冊[12]采用MSC 固相萃取小柱提取、凈化雞蛋等高蛋白樣品。依據上述信息，本實驗對比了C18、MSC 兩種固相萃取小柱對牛奶樣品中氯霉素的提取效果，為牛奶中氯霉素的測定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500 質譜分析儀（美國AB SCIEX）；Ag?ilent 1290 高效液相色譜儀（美國安捷倫）；高速冷凍離心機（湖南赫西儀器）；振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；旋轉蒸發儀（德國IKA）；氮吹儀（Reeko Auto EVA-30）；電子天平（Sartorius,0.01 mg）；均質器；Agela Technologies Cleanert MCS-SPE固相萃取小柱（500 mg/6 mL）；Agela Technologies Cleanert S C18-SPE固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。

液態牛奶，市購；氯霉素（壇墨質檢-國家標準物質中心）；氯霉素-D5（壇墨質檢-國家標準物質中心）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，美國JT Baker）；氨水、氯化鈉（分析純）；正己烷（優級純）；實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

準確量取氯霉素標準溶液25 μL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，得到25.00 ng/mL 的氯霉素應用液。準確量取氯霉素-D5 標準溶液20 μL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，得到20.00 ng/mL 的氯霉素-D5 應用液。標準應用液均于4 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品的提取

取10 g（精確至0.01g）均質好的牛奶樣品于50 mL離心管中，加氯霉素-D5 標準應用液100 μL，再加乙酸乙酯20 mL，振蕩15 min，5 000 r/min 離心10 min，取乙酸乙酯層于雞心瓶中。再加20 mL 乙酸乙酯重復提取一次，合并兩次提取液，于40 ℃水浴旋轉蒸發至干。用5 mL 4%氯化鈉溶液溶解殘留物，加5 mL 正己烷振蕩混合1 min，靜置分層，棄去正己烷。再加正己烷5 mL，重復提取一次，取下層液備用。

1.2.3 樣品的凈化

C18及MCS小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，取備用液分別過C18 及MCS 固相萃取小柱，用5 mL水淋洗抽干，再用5 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃下氮氣吹干。用1.0 mL甲醇溶解殘留物，渦旋混勻，過0.22 μm 濾膜，供超高效液相-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定。

1.2.4 儀器條件

色譜：Syncronis C18 色譜柱（100×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：0.05%氨水，流動相B：乙腈，梯度洗脫程序件（見表1）；流速：0.40 mL/min，分析時間5 min，進樣體積5 μL，柱溫30 ℃。

表1 流動相梯度洗脫

質譜：離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：負離子模式；檢測方式：多反應監測（MRM）；電離電壓：4.0 kV；檢測方式：多反應檢測（MRM）；離子源溫度：500 ℃；噴霧器壓力：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；氣簾氣壓力：35 psi；其他參數見表2。

表2 各化合物質譜參數

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

根據待測物的性質，使用氯霉素及氯霉素-D5 標準應用液在ESI-模式下分別進行質譜條件優化。選擇每種藥物響應強度最高的m/z 值作為母離子，進行子離子掃描，并優化去簇電壓和碰撞電壓。并在MRM 模式下優化了氣簾氣、離子源溫度、噴霧氣、輔助加熱氣。

2.2 色譜條件優化

本文實驗了Hypersll GOLD色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm），Syncronis C18 色譜柱（100×2.1 mm，1.7 μm），發現采用Hypersll GOLD 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm）分離時，色譜峰展寬，響應值偏低。采用Syncronis C18色譜柱（100×2.1 mm，1.7 μm）分離時，色譜峰得到較大改善，峰形收窄，響應增高，基線噪音降低，實現更低檢出限。

本文選擇流動相時考慮到是ESI-模式，所以使用了0.05%氨水及具有改善峰形作用的乙腈。低流速時，峰形展寬、拖尾，綜合分離效果及柱壓等因素，最終選擇0.4 mL/min 流速。圖1 為1.00 ng/mL 的氯霉素標準溶液MRM 譜圖。

圖1 CPA標準MRM譜圖

2.3 樣品前處理方法的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

本文試驗了乙腈-乙酸乙酯（10：90）、乙腈-乙酸乙酯（20：80）、乙腈-乙酸乙酯（50：50）及乙酸乙酯的提取效果。乙腈-乙酸乙酯（10：90）、乙腈-乙酸乙酯（20：80）分層效果不理想，震搖乳化。乙腈-乙酸乙酯（50：50）提取，分層效果較好（分為乙腈層、磷脂層、乙酸乙酯層），但加標回收率較低，在21.6%～48.5%之間。乙酸乙酯，振蕩提取效果較好，回收率均能達50%以上。

圖2 不同提取溶劑對比

2.3.2 提取方法的選擇

本文比較了《2019 年國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》[11]中用乙酸乙酯提取一次，氮氣吹干水溶解過固相萃取小柱提取、凈化，及GB 29688-2013《牛奶中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》[12]中乙酸乙酯提取兩次，旋轉蒸發至干，水溶液溶解過固相萃取小柱提取、凈化。實驗發現，手冊的提取方法損失較大，回收率均于60%以下，國標方法提取效果較佳。

2.3.3 固相萃取柱的選擇

本文進行了0.10、0.50、2.50、10.00 ng 4 個水平的加標回收實驗，比較了C18 及MCS 兩種固相萃取小柱對氯霉素的保留能力。結果表明MCS 固相萃取小柱4 個水平的回收均實現75%以上，而C18 固相萃取小柱在低水平回收實驗中效果不佳，回收率低于50%。實驗結果見表3。

表3 兩種固相萃取柱的回收率（%）

2.4 標準曲線及檢出限

用甲醇將氯霉素-D5 及氯霉素標準應用液制備成含氯霉素-D5 2.00 ng/mL，含氯霉素分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 ng/mL 的標準工作溶液，在確定的分析條件下進行測定，以標準溶液質量濃度為橫坐標，氯霉素與氯霉素-D5 響應值之比為縱坐標繪制標準曲線，得到的線性方程、相關系數及檢出限見表4。

表4 氯霉素的線性方程、相關系數、檢出限

2.5 精密度及準確度

圖3 工作曲線

取不含氯霉素的牛奶樣品分別過C18 及MCS 固相萃取小柱進行三水平加標回收率實驗，結果見表5。由表中可見，C18 固相萃取小柱回收率在31.4%～155%之間，在低水平及高水平的回收率均不理想，而MCS 固相萃取小柱在三個水平的加標回收率均能達到50.4%以上。結合上述固相萃取小柱回收試驗，說明MCS 固相萃取小柱有更良好的準確性，適宜于牛奶中氯霉素殘留的痕量測定。圖4 為牛奶樣品添加氯霉素的MRM 譜圖。

表5 氯霉素在不同加標水平下的加標回收率及相對標準偏差（n=3）

圖4 加標樣品MRM譜圖

3 結 論

本研究采用2 種不同的固相萃取小柱對牛奶中的氯霉素進行提取、富集和凈化，通過對回收率、精密度、定量限等指標進行考察，得出MCS 固相萃取小柱損失小，回收率高，同時檢出限可達到0.004 μg/kg，遠低于國標方法，且穩定性高，適用于大量樣品的集中測定。

建立了UPLC-MS/MS 內標法測定牛奶中氯霉素含量的方法。分析過程中引入氯霉素-D5 作為內標物，對于分析全過程中導致目標物損失給予完全的校正，改善了方法的精密度。以Syncronis C18 色譜柱分離，流動相為0.05%氨水和乙腈，電噴霧負離子MRM 模式檢測。該法測定周期短、定性、定量準確，適用于痕量氯霉素的檢測。