高效液相色譜法測(cè)定飲料中乙酰磺胺酸鉀含量的不確定度評(píng)定

（吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130062）

測(cè)量不確定度指根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)[1]。測(cè)量不確定度是一個(gè)與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，一個(gè)完整的檢測(cè)結(jié)果，不僅要給出被測(cè)量的最佳預(yù)測(cè)值，還需給出測(cè)量結(jié)果的不確定度[2]，因此測(cè)量不確定度在檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[3-6]。近年來(lái)，各種具有抗疲勞、抗氧化、鎮(zhèn)靜安眠等保健功能的保健食品不斷涌現(xiàn)，其中基于天然產(chǎn)物的食品和飲料尤其引人關(guān)注。我國(guó)東北地區(qū)具有豐富的天然植物資源，基于天然產(chǎn)物的飲料如基于五味子、玫瑰茄、野生藍(lán)莓和樹莓、刺五加等的飲料[7-8]，原料來(lái)源豐富，具有各種獨(dú)特的保健功效，除其中的活性成分外，飲料中添加劑成分的含量測(cè)定也是飲料質(zhì)量監(jiān)控的重要環(huán)節(jié)。乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜）為人工合成甜味劑，廣泛用于飲料、糖果、糕點(diǎn)、果醬等食品中[9]，我國(guó)強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[10]中明確規(guī)定飲料中乙酰磺胺酸鉀最大使用量0.3g/kg。目前，乙酰磺胺酸鉀測(cè)定方法包括高效液相色譜法[11]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、離子色譜法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]等。本研究根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[1]、GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》[15]和CNASGL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[16]的要求，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定飲料中乙酰磺胺酸鉀含量[17]的不確定度進(jìn)行分析和評(píng)定，旨在找出檢測(cè)方法中不確定度的主要來(lái)源，確定測(cè)定結(jié)果的主要影響因素及可信程度，為正確評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

乙酰磺胺酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）：0.25g（純度≥99%）。

1.2 儀器設(shè)備

LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；AS3120超聲波提取儀（脫氣用）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（4.6mm×150mm×5μm）；流動(dòng)相：0.02mol/L硫酸銨（800）+甲醇（150）+乙腈（50）+10%H2SO4(1ml)；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μL。

1.4 樣品前處理

吸取2.5ml果汁飲料，加水約20ml，混勻后，4000r/min離心15min，上清液全部轉(zhuǎn)入中性氧化鋁柱，待水溶液濾至柱表面時(shí)，用流動(dòng)相洗脫，收集洗脫液25ml，混勻，超聲脫氣，待HPLC分析用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取0.1000g乙酰磺胺酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，配成0.04mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，再分別吸取此溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml于10ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，混勻，配制成濃度分別為0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml、0.020mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.6 測(cè)定方法

取上述待測(cè)液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)0.45μm濾膜后，分別吸取10μL進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定其峰面積，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得測(cè)定液中乙酰磺胺酸鉀的含量。

1.7 計(jì)算方法（數(shù)學(xué)模型）

式中：X為試樣中乙酰磺胺酸鉀的含量（mg/L）；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上樣液中乙酰磺胺酸鉀的含量（μg/ml）；V為試樣稀釋總體積（ml）； m為試樣取樣量（g）。

2.結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量模型和不確定度計(jì)算公式

（1）測(cè)量模型。根據(jù)上述計(jì)算公式，并考慮其他因素，得到用于測(cè)量不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型。

目前，化學(xué)測(cè)量中，測(cè)量結(jié)果以方法中計(jì)算公式得到的單個(gè)測(cè)得值或平均值報(bào)告，忽視了測(cè)量不確定度的存在，報(bào)告的是不完整的測(cè)量結(jié)果。測(cè)量不確定度評(píng)定就是為了更科學(xué)、更準(zhǔn)確地表達(dá)測(cè)量結(jié)果的。結(jié)果應(yīng)表達(dá)為：

y=X±U(y)

式中，y為試樣中乙酰磺胺酸鉀的測(cè)量結(jié)果（mg/ml）；X為一次試樣中乙酰磺胺酸鉀的測(cè)得值（mg/ml）；U(y)為測(cè)得值的擴(kuò)展不確定度（mg/ml）。

測(cè)量模型函數(shù)關(guān)系表達(dá)式為：

Y=f(X1、X2、X3…… Xn)

式中，Y為飲料中乙酰磺胺酸鉀含量，這里X1、X2……、Xn表示魚骨刺圖中一級(jí)因素（與分量匯總表中的分量一致），并標(biāo)識(shí)下面計(jì)算時(shí)用到的縮寫字母。如下式表示：

Y=f (c, v, v1)

式中，Y為試樣中乙酰磺胺酸鉀的含量（mg/ml）；f為測(cè)量函數(shù)；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的進(jìn)樣液中乙酰磺胺酸鉀的含量（mg/ml）；V1為試樣稀釋總體積（ml）；V為試樣體積(ml)。

（2）不確定度計(jì)算公式。相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式：

式中，urel(y)為測(cè)得值的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(xn)為xn的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。xn的不確定度具體計(jì)算公式見具體分量評(píng)定。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

uc(y)=Xurel(y)

擴(kuò)展不確定度計(jì)算公式為：

U=kuc(y)

2.2 不確定度來(lái)源分析

影響飲料中乙酰磺胺酸鉀含量的測(cè)量結(jié)果的各不確定度分量可從測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型中分析其來(lái)源。最終的不確定度來(lái)源分析，見圖1。

圖1 魚骨刺圖

（1）測(cè)量重復(fù)性。此分量受多種測(cè)量條件影響，為避免重復(fù)引入，將有影響的分量合并為總測(cè)量過(guò)程的一個(gè)分量，由測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性表示，結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（2）樣品體積（V）。主要來(lái)源于吸取樣品、稀釋過(guò)程中體積重復(fù)性及測(cè)量過(guò)程中溫度差異帶來(lái)的不確定度。

（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)溶液）。主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)定值的不確定度以及稱量、稀釋過(guò)程中體積不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來(lái)的不確定度，結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

（4）樣品制備分析過(guò)程中回收率帶來(lái)的不確定度。

2.3 不確定度分量評(píng)定

（1）測(cè)量結(jié)果重復(fù)性引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(rep)樣品測(cè)量分量 ： X1，X2，X3，X4，X5，X6…… n ≥ 6。

測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2）樣品體積（V）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v)吸取2.50ml樣品溶液，按1.4方法處理后，收集25ml濾液。

1）刻度吸管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，包括5.00mlA級(jí)刻度吸管校準(zhǔn)（允差±0.015ml）、溫度變化（20℃時(shí)，水的膨脹系數(shù)α=2.1×10-4℃-1，設(shè)溫度變化±3℃）[18]和體積重復(fù)性（2.3（1）中已經(jīng)統(tǒng)一考慮）引入的不確定度。

①校準(zhǔn)不確定度：

②溫度變化引入的不確定度：

2）容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，包括25.0mlA級(jí)容量瓶校準(zhǔn)（允差±0.03ml）、溫度變化和體積重復(fù)性（2.3（1））引入的不確定度。

①校準(zhǔn)不確定度：

②溫度變化引入的不確定度：

（3）濃度（C）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C) 準(zhǔn)確稱取0.1000g乙酰磺胺酸鉀標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，溶解并定容至25ml,混勻；吸取10.00ml定容至100ml，混勻；吸取1.00ml定容至10ml,混勻。

1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)溶液）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、稱量引入的不確定度。

①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，不確定度為1%：

②稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

用萬(wàn)分之一天平稱取0.1000g±0.0001g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2）逐級(jí)稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（同2.3（2））

①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋用25ml±0.010ml容量瓶：

②標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋用10ml±0.092ml無(wú)分度吸管：

③標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋用100ml±0.02ml容量瓶：

④標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋用10ml±0.004ml容量瓶：

⑤標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋用1.00ml±0.015ml無(wú)分度吸管：

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度（最小二乘法擬合）

其中，a為直線的截距；b為直線的斜率

其中，yi為各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值；y為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算的理論值；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的總點(diǎn)數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其中X0為待測(cè)樣品濃度的平均值（mg/ml）；p為待測(cè)樣品重復(fù)測(cè)定的次數(shù)；為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的平均值（mg/ml）；Xi為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算得出的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度值（mg/ml）。

計(jì)算數(shù)據(jù)見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度計(jì)算數(shù)據(jù)

（4）回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1）第一種方法：貝塞爾公式法（n≥6適用此法）

該方法六次（n=6）測(cè)定的回收率分別為94.4%、98.9%、86.7%、90.0%、92.2%、92.2%，平均回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差s(Rec)=0.041，其不確定度計(jì)算公式為：

2）第二種方法：極差法（4≤n≤9適用此法）

該方法六次（n=6）測(cè)定的回收率分別為94.4%、98.9%、86.7%、90.0%、92.2%、92.2%，平均回收率。

式中：R位極差（最大值與最小值之差）； C為極差系數(shù)（可從JJF1059.1-2012中極差系數(shù)表中查出）。

（5）不確定度分量評(píng)定結(jié)果。

不確定度分量評(píng)定結(jié)果見表4。

表4 各分量的不確定度的匯總表

2.4 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）其中回收率引入不確定度由貝塞爾法計(jì)算。

（2）其中回收率引入不確定度由極差法計(jì)算。

2.5 擴(kuò)展不確定度及測(cè)量結(jié)果報(bào)告

2.5.1 確定擴(kuò)展不確定度

（1）按照國(guó)際慣例[15]，95%置信概率下取包含因子k=2，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

U =κ×urel

1）U=3.15×10-2×2=0.0630 （其中回收率引入不確定度由貝塞爾法計(jì)算）。

2）U=3.34×10-2×2=0.0668 （其中回收率引入不確定度由極差法計(jì)算）。

（2）通過(guò)相對(duì)擴(kuò)展不確定度計(jì)算擴(kuò)展不確定度U：

1）U(x)=0.0630×0.083=0.006 mg/mL （其中回收率引入不確定度由貝塞爾法計(jì)算）。

2）U(x)=0.0668×0.083=0.006 mg/mL （其中回收率引入不確定度由極差法計(jì)算）。

2.5.2 測(cè)量結(jié)果報(bào)告及表述

測(cè)量結(jié)果表達(dá)為：Y=±U(y)

按以上計(jì)算結(jié)果，飲料中乙酰磺胺酸鉀的測(cè)定結(jié)果表示為 ： (0.083±0.006) mg/ml。

3.結(jié)論

（1）通過(guò)對(duì)不確定度的來(lái)源分析和評(píng)定，可知高效液相色譜法測(cè)定飲料中乙酰磺胺酸鉀含量的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和回收率引入的不確定度分量，因此在測(cè)定過(guò)程中應(yīng)做好標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和擬合的質(zhì)量控制工作，進(jìn)一步規(guī)范檢驗(yàn)人員操作，減少不規(guī)范操作引起的誤差，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（2）可通過(guò)貝塞爾法和極差法計(jì)算回收率引入的不確定度，測(cè)定次數(shù)n≥6適用貝塞爾法，測(cè)定次數(shù)在4≤n≤9適用于極差法，若測(cè)定次數(shù)均在兩個(gè)方法適用范圍內(nèi)，則采用兩個(gè)方法計(jì)算回收率引入的不確定度，計(jì)算結(jié)果無(wú)差異。

（3）檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性受到檢測(cè)過(guò)程中諸多因素影響，需有效識(shí)別檢測(cè)過(guò)程中各影響因素，分析不確定度分量來(lái)源，對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)控。因此不確定度評(píng)定是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證的重要手段之一，為科學(xué)準(zhǔn)確報(bào)告檢測(cè)結(jié)果提供了參考。