Bmi-1對腎癌細胞遷移侵襲能力的影響及機制

成 瓊，郭艷萍，李 真，李 彩，陳錦輝，向 錚，孔令非

(1. 河南省人民醫院病理科，鄭州大學人民醫院，河南 鄭州 450003；2.鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡稱腎癌，是泌尿生殖系統最常見的腫瘤之一，發病率約占成人惡性腫瘤的3%。因其早期通常沒有明顯癥狀，臨床表征也各不相同，有約25%～30%的患者在確診時已到晚期。由于腎癌對化療和放療均不敏感，目前以外科切除為主要治療手段，但復發及轉移仍是腫瘤手術治愈的困惑及難題[1]。相對于其他惡性腫瘤，腎癌的治療還需要依賴全身性、個性化治療如生物靶向治療(biologically targeted therapy)等。因此，尋找敏感的腎癌生物標志物和特異性的治療靶點對提高腎癌患者生存期具有重要意義。

Bmi-1基因屬原癌基因，多梳基因家族(poly-comb group genes，PcG)成員之一，其編碼的蛋白質產物幾乎在所有的組織均有表達[2]。Bmi-1因其可修復損傷DNA、抑制某些基因轉錄，進而影響多種腫瘤的發生、發展及預后。研究發現[3]，Bmi-1小分子抑制劑 PTC-209通過抑制 Bmi-1的活性，經PRC1下調CDKN2A的轉錄活性，從而抑制 p16 INK4A 和 p14 ARF 等下游靶點，達到阻滯腫瘤細胞周期進展，殺傷血液腫瘤細胞的作用。Liang等[4]發現Bmi-1表達增高與膀胱癌腫瘤大小、分級、分期以及淋巴轉移呈正相關，抑制Bmi-1可降低膀胱癌的侵襲能力。大量文獻報道Bmi-1與胰腺癌、乳腺癌以及前列腺癌的預后密切相關[5]。在腎癌，有研究者發現Bmi-1在腎癌癌周組織中高表達[6]。區景遠等[7]也研究發現Bmi-1小分子抑制劑PTC-209可抑制腎癌細胞增殖，促其凋亡。

綜上，目前未見有Bmi-1與腎癌的深入研究，仍需要進一步的研究明確。本研究將探討Bmi-1沉默對人腎癌細胞株786-O、ACHN的遷移侵襲的影響，了解其相關信號通路，為探討Bmi-1與腎癌的發生發展提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人腎小管上皮細胞HK-2，腎癌細胞株786-O、ACHN購自中國科學院上海細胞庫。人腎小管上皮細胞HK-2、腎癌細胞株786-O、ACHN為貼壁生長細胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培養基置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞長滿85%的視野時，用胰酶消化，離心5 min，棄上清。加入10 mL培養基，反復吹打使細胞均勻分散，接種于培養皿中備用。

1.1.2試劑 高糖DMEM培養基購自Hyclone公司(貨號：SH30022.01)。SilectFectTMLipid Reagent購自美國Bio-Rad公司產品(貨號：1703362)。Transwell小室購自美國康寧公司(貨號：3422)，Matrigel膠購自美國BD公司(貨號：356234)。Bmi-1 siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。Bmi-1(貨號：6964)、E-cadherin(貨號：3195)、Vimentin(貨號：5741)、Akt(貨號：4691)、p-Akt(貨號：4060)抗體購自Cell Signaling Technology公司，無噬菌體低內毒素優級胎牛血清購自四季青公司(貨號：11011-8611)β-actin(貨號：AF0003)、胰酶(貨號：C0201)、細胞裂解液(貨號：P0013B)、結晶紫染色液(貨號：C0121)、ECL反應液(貨號：P0018M)均購自碧云天生物科技有限公司。

1.1.3儀器 細胞培養箱、生物安全柜和酶標儀(Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；電泳儀、電泳槽及凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1siRNA沉默腎癌細胞株Bmi-1的蛋白表達 待細胞處于約50%～60%融合時進行轉染。按6 cm直徑培養皿的標準計算，每孔加入siRNA-Ctrl或siRNA-Bmi-1，用SilectFect轉染試劑進行轉染，轉染48 h后提取蛋白觀察轉染效率。si-Ctrl及si-Bmi-1序列依照何等文獻報導[8]。

1.2.2劃痕實驗檢測沉默Bmi-1后腎癌細胞劃痕愈合能力 采用細胞劃痕實驗觀察沉默Bmi-1后786-O、ACHN細胞的遷移能力。轉染siRNA的細胞接種到6 孔板，無血清的培養基培養過夜使細胞停止增殖。無菌槍頭在6 孔板內迅速劃痕，并在劃痕旁做標記，用無血清培養基繼續培養。分別于劃痕的0 h和24 h后置于倒置顯微鏡下拍照，測量劃痕間距。劃痕愈合率/%=(劃痕間距0 h-劃痕間距24 h)/劃痕間距0 h×100%。

1.2.3Transwell小室遷移實驗檢測沉默Bmi-1后腎癌細胞遷移能力 收集轉染siRNA的細胞，以無血清培養基制成濃度為1×107·L-1的細胞懸液，取150 μL加入小室，置于加入600 μL含高糖DMEM培養基的12孔板繼續培養。24 h后，取出Transwell小室，用甲醇固定30 min后再以結晶紫染色10 min，棉簽拭去Transwell小室底部未遷移的細胞，自然風干。顯微鏡200倍視野下隨機取6個視野拍照，取平均值并統計結果。

1.2.4Transwell小室侵襲實驗檢測沉默Bmi-1后腎癌細胞侵襲能力 786-O、ACHN細胞轉染48 h后，以無血清培養基重懸細胞加入鋪有Matrigel膠的Transwell小室，置培養箱中過夜。24 h后，甲醇固定并以結晶紫染色，棉簽擦拭去除小室底部膜表面上的細胞后，顯微鏡下隨機取6個視野拍照，每組細胞重復3次實驗，取平均值并統計結果。

1.2.5Western blot檢測遷移侵襲轉移相關蛋白的表達 細胞以PBS沖洗3遍，加入適量中性細胞裂解液提取總蛋白，蛋白定量(BCA)法測量蛋白濃度，以裂解液和5×上樣緩沖液處理同組蛋白為等濃度、等體積和等質量。SDS-PAGE電泳后轉膜至PVDF膜上。封閉液封閉2 h后一抗4 ℃孵育過夜。洗膜液洗膜15 min后，再以相應二抗孵育2 h，洗膜后經ECL化學發光顯影。

2 結果

2.1 Bmi-1在腎癌細胞中高表達與腎小管上皮細胞HK-2相比，786-O、ACHN兩種腎癌細胞株Bmi-1的蛋白表達顯著增多(P<0.01，Fig 1)。

Fig 1 Bmi-1 expression in human renal endothelial cells and renal cancer cells

2.2 沉默Bmi-1后Bmi-1蛋白表達水平顯著降低免疫印跡結果顯示，與對照組相比，siRNA特異性干擾片段能使兩種腎癌細胞Bmi-1蛋白表達量明顯降低(P<0.05，Fig 2)。

2.3 沉默Bmi-1后對786-O和ACHN劃痕愈合能力的影響SilectFect轉染siRNA 48 h后，細胞劃痕實驗檢測Bmi-1對細胞劃痕愈合能力的影響。如圖所示，0 h si-Ctrl組和si-Bmi-1組腎癌細胞的劃痕距離無顯著差異，24 h后 si-Bmi-1組相對于si-Ctrl組細胞劃痕愈合能力明顯減弱(P<0.05，Fig 3)。提示抑制Bmi-1能減弱細胞的劃痕愈合能力。

Fig 2 Bmi-1 expression in renal cancer cells after knockdown of Bmi-1

2.4 沉默Bmi-1使細胞的遷移能力下降如圖4所示，轉染siRNA 48 h后，與si-Ctrl組相比，si-Bmi-1組遷移的細胞數量明顯減少，細胞數量的百分比由100%下降到47.5%，差異有統計學意義(P<0.05)。提示Bmi-1對786-O及ACHN兩種細胞的遷移能力可能具有重要調節作用(Fig 4)。

2.5 沉默Bmi-1使細胞的侵襲能力明顯下降實驗結果顯示，在沉默Bmi-1 48 h 后穿膜細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。提示Bmi-1對腎癌細胞的侵襲能力可能具有重要調節作用(Fig 5)。

2.6 下調Bmi-1的表達后對腎癌遷移、侵襲相關蛋白表達的影響Western blot檢測Bmi-1沉默后，786-O及ACHN的E-cadherin、Vimentin、Akt和p-Akt蛋白表達水平。結果發現，沉默Bmi-1后兩種腎癌細胞株上皮標志物E-cadherin表達水平增加，而間質標志物Vimentin的表達水平降低，說明Bmi-1沉默后抑制了上皮-間質轉化的發生。沉默Bmi-1后兩種腎癌細胞株Akt蛋白表達無顯著差異，而p-Akt蛋白表達水平明顯降低，提示Bmi-1對腎癌細胞遷移侵襲的調控可能與Akt的活化密切相關(Fig 6)。

Fig 3 Effect of Bmi-1 knockdown on wound healing ability of renal cancer cells

3 討論

腎癌是泌尿系統常見惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢。腫瘤復發是當前腎癌患者治療所擔憂的重大難題，有近 40%的患者在術后 5 年內出現腫瘤復發[9]。由于其對放化療均不敏感，因此術后輔助以靶向藥物治療，可預防腫瘤復發轉移，提高患者術后生存率。

由多種調控細胞周期、細胞增殖的轉錄因子組成的多梳基因家族(PcG)，在維系胚胎發育、干細胞及腫瘤發生中有著舉足輕重的作用[10]，定位于人10號染色體短臂1區3帶的Bmi-1即為PcG的成員之一。大量研究表明，Bmi-1的高表達與多種腫瘤發生、遷移和遠端轉移成正相關[11]。Srinivasan等[12]發現Bmi-1可促進乳腺癌患者疾病的發生和發展。Notch 及其信號通路是許多重要信號通路的主要組成部分，其受體激活后可經一系列酶促反應使其移位至細胞核，與核內轉錄因子形成轉錄因子復合物，激活下游如HES1、Cyclin D1、Bcl-2等影響細胞增殖及遷移的靶基因，使其轉錄活性增強。

Fig 4 Effect of Bmi-1 knockdown on migration ability of renal cancer cells

正常上皮細胞由多細胞構成，于基底膜相互黏附緊密而不移動。上皮細胞最主要的黏附結構是上皮性鈣粘蛋白(E-cadherin)介導的細胞間連接結構。而間質組織多由結構松散、具有運動能力的細胞構成。任何能夠干擾E-cadherin的因素均可導致細胞間黏附不穩定，發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT中發生的關鍵分子是E-cadherin表達下調，失去細胞與細胞之間的粘附、破壞基底膜及細胞外基質，惡性細胞就會進入間質而到處移動，使腫瘤細胞進入血流而發生遠端轉移及復發[13]。Bmi-1可能在蛋白水平直接與腫瘤浸潤轉移相關因子發生作用。本實驗結果發現，Bmi-1基因沉默后，兩種腎癌細胞株的遷移侵襲能力均顯著下降。且Bmi-1表達降低后，可使E-cadherin的蛋白表達水平增高，Vimentin的表達水平降低。提示Bmi-1參與了腎癌細胞的EMT的調控。研究者發現PI3K/Akt信號通路能直接影響Snail、Slug等下游靶基因E-cadherin的轉錄，誘導EMT的發生[14-15]。Akt作為PI3K/Akt信號通路上重要的蛋白激酶，是否參與Bmi-1對腎癌細胞的EMT的調控，本實驗結果發現，沉默Bmi-1后Akt的磷酸化水平也隨之降低，并伴隨上皮標志物E-cadherin表達增高，間質標志物Vimentin蛋白表達的降低。提示PI3K/Akt信號通路參與Bmi-1對腎癌細胞遷移侵襲的調控。

Fig 5 Effect of Bmi-1 knockdown on invasion ability of renal cancer cells

Bmi-1基因在泌尿系腫瘤的侵襲進展中具有非常重要的意義，其在前列腺癌等多種腫瘤中均有相關報道其與促進腫瘤發生，腫瘤轉移密切相關。這就需要我們進一步深入研究，使Bmi-1有望在未來成為新的泌尿系統腫瘤標志物，對患者的泌尿系惡性腫瘤的早期診斷、治療方案的制定、預后預測等具有臨床應用和指導價值。

Fig 6 Protein levels of E-cadherin, Vimentin and Akt detected by Western blot