G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子6對(duì)心肌細(xì)胞肥大的作用及機(jī)制研究

舒婧嫻，陸 瑤，蔡菁菁，鄢光宇，陳子瑩，劉媛媛，袁 洪

(1. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院臨床藥理中心，湖南 長沙 410013；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 珠海 519000；3. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 長沙 410013)

心肌肥厚是不同病因所致進(jìn)展性心衰共同的病理生理環(huán)節(jié)，是增加心衰等心血管疾病死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]。《中國心血管病報(bào)告2018》顯示我國心血管疾病的患病人數(shù)2.9億人，由其引發(fā)的死亡占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上、居首位[2]。心肌肥厚的主要原因包括心肌細(xì)胞變性、肥大等，在心肌細(xì)胞病理變化的過程中，不同的胞膜受體啟動(dòng)相應(yīng)信號(hào)通路，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3]，引起肥大相關(guān)基因和心肌細(xì)胞表型的變化。

目前研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子(regulators of G-protein signaling，RGS)家族成員通過RGS結(jié)構(gòu)域與G蛋白結(jié)合，加速G蛋白的活性降解而發(fā)揮生理病理調(diào)節(jié)作用[4]，其中部分RGS因子通過該結(jié)構(gòu)域發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用[5]。RGS6是RGS蛋白家族重要成員之一，它包含3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：RGS、DEP/DHEX和GGL。RGS結(jié)構(gòu)域具有G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)的作用，DEP與RGS6的細(xì)胞質(zhì)膜定位有關(guān)，GGL結(jié)構(gòu)域使G蛋白復(fù)合物與跨膜受體迅速解離，因此它是RGS蛋白家族中唯一具有G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)和非G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)雙重功能的成員[6]。RGS6在心臟中可通過負(fù)性調(diào)控毒蕈堿受體偶聯(lián)的G蛋白使其失活，發(fā)揮調(diào)節(jié)心臟自律性的作用[7]。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)RGS6通過調(diào)控線粒體中活性氧(reactive oxygen species，ROS)-共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因/p53基因(非G蛋白信號(hào)通路)介導(dǎo)多柔比星的心肌毒性反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)線粒體在心肌細(xì)胞肥大的病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，線粒體通過產(chǎn)生ROS并激活下游絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase，MAPK)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大[9]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK1/2)、p38均屬于MAPK家族成員，可以傳遞ROS對(duì)心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用，但不同刺激因素激活的具體MAPK信號(hào)通路仍有待研究[10-11]。

本研究前期用血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，Ang Ⅱ)構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型，發(fā)現(xiàn)RGS6表達(dá)明顯增加，提示RGS6可能是另一個(gè)RGS家族中與心肌細(xì)胞肥大相關(guān)的重要成員，但RGS6致心肌細(xì)胞肥大的作用有待進(jìn)一步證實(shí)，其調(diào)控心肌肥厚的作用機(jī)制目前亦不清楚。本研究擬圍繞RGS6調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的作用及機(jī)制，通過慢病毒構(gòu)建RGS6過表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞模型，研究RGS6表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響，探討RGS6調(diào)控ROS-MAPK信號(hào)通路中ERK1/2、JNK1/2、p38的變化，為干預(yù)心肌肥厚的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑特級(jí)胎牛血清(Gibco，10099-141)、DMEM/高糖培養(yǎng)基(HyClone，SH30022.01)、0.25%胰蛋白酶Trypsin-EDTA(Gibco，25200056)、AdRGS6和AdGFP慢病毒(漢恒生物科技有限公司，15011243)、AdshRGS6和AdshRNA慢病毒(漢恒生物科技有限公司，11090124)、血管緊張素Ⅱ(Sigma，A9525)、二聯(lián)苯碘DPI (Sigma，D2926)、二甲基亞砜DMSO(Sigma，D2650)、兔抗RGS6抗體(Abcam，ab128943)、兔抗ERK1/2抗體(Abcam，ab184699)、兔抗p-ERK1/2抗體(Signaling Antibody，12082)、兔抗p38抗體(Abcam，ab170099)、兔抗p-p38抗體(Abcam，ab195049)、兔抗JNK1/2抗體(Signaling Antibody，21504)、兔抗p-JNK抗體(Signaling Antibody，12345)、兔抗GAPDH抗體(Bioworld Technology，AP0066)、山羊抗兔IgG抗體(Abcam，ab6721)、鬼筆環(huán)肽(Invitrogen，F(xiàn)36924)、DAPI(Invitrogen，S36939)、活性氧檢測(cè)熒光探針-DHE(北京百奧萊博科技有限公司，KFS377)。

1.2 主要儀器生物安全柜(蘇州蘇凈安泰AIRTECH有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂Bio-Rad公司)、PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)、恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯IX71)、電泳儀(上海天能科技有限公司)、冷凍離心機(jī)和移液槍(艾本德Eppendorf公司)、CLARIOstar全波長掃描熒光酶標(biāo)儀(德國BMG LABTECH公司)

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與肥大刺激取大鼠H9C2心肌細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化、離心后取底部細(xì)胞團(tuán)塊并加入新鮮培基，六孔板接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。分配好實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組后，次日在實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為0.1 μmol·L-1Ang Ⅱ，對(duì)照組加入等量的PBS。

1.4 慢病毒感染細(xì)胞及其干預(yù)采用攜帶大鼠RGS6基因的慢病毒(AdRGS6)、攜帶ZsGreen綠色熒光蛋白基因的慢病毒(對(duì)照組：AdGFP)、攜帶大鼠RGS6短發(fā)卡序列的慢病毒(AdshRGS10)和帶空白R(shí)NA序列的慢病毒(對(duì)照組：AdshRNA)對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行感染。取培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞并加入polybrene使其終濃度為6 mg·L-1，孵育，替換新鮮培養(yǎng)基后加入100 μL對(duì)應(yīng)病毒感染。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組① AdGFP/PBS組；② AdRGS6/PBS組；③ AdGFP /Ang Ⅱ組；④ AdRGS6/Ang Ⅱ組；⑤ AdshRNA/PBS組；⑥ AdshRGS10/PBS組；⑦ AdshRNA/Ang Ⅱ組；⑧ AdshRGS6/Ang Ⅱ組。

1.6 細(xì)胞免疫熒光染色和細(xì)胞大小檢測(cè)取1.4中的心肌細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定15 min，棄去并洗凈后加入5 mg·L-1的鬼筆環(huán)肽室溫染色60 min，等滲溶液清洗細(xì)胞，再用DAPI染細(xì)胞核10 min，封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和大小，Image J軟件統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞面積。

1.7 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定取1.4中各組細(xì)胞，采用活性氧檢測(cè)熒光探針-二氫乙啶(DHE)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS含量。加入稀釋后的熒光探針，使探針的終濃度為10 μmol·L-1，避光、孵育60 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。

1.8Westernblot提取1.4中各組心肌細(xì)胞的總蛋白，用10 μL蛋白上樣、電泳，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉，緩沖鹽溶液(TBST)洗滌后孵相應(yīng)的一抗過夜。TBST洗滌3次后，加入二抗、室溫孵育2 h，清洗膜后加ECL 超敏發(fā)光液進(jìn)行蛋白條帶顯影，用Image Lab分析各條帶的灰度值。

1.9RT-PCR采用TRIzol法提取各組心肌細(xì)胞中的總RNA并檢測(cè)總RNA的濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA，取各組cDNA進(jìn)行ANP、BNP和GAPDH的RT-PCR反應(yīng)。引物序列見Tab 1。

Tab 1 RT-PCR primers

1.10 逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)將感染AdRGS6和AdGFP慢病毒的心肌細(xì)胞用終濃度為0.1 μmol·L-1的二聯(lián)苯碘DPI處理2 h(對(duì)照組加入等量二甲基亞砜處理2 h)，然后各組加入終濃度為0.1 μmol·L-1的Ang Ⅱ處理24 h。分為四組：AdGFP/Ang Ⅱ/二甲基亞砜(DMSO)、AdRGS10/Ang Ⅱ/DMSO、AdGFP/Ang Ⅱ/ROS抑制劑(DPI)、AdRGS10/Ang Ⅱ/DPI。

2 結(jié)果

2.1 RGS6過表達(dá)/抑制表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞大小的影響用Ang Ⅱ和PBS分別處理已轉(zhuǎn)染慢病毒的心肌細(xì)胞，于熒光顯微鏡(×400)下觀察細(xì)胞面積，隨機(jī)圈出各組20個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞面積并取平均值。與AdGFP/PBS組相比，AdRGS6/Ang Ⅱ組和AdGFP/Ang Ⅱ組細(xì)胞面積均明顯增加(1 889±182vs4 761±232、1 889±182vs3 520±407，n=20，P<0.05)；AdRGS6/Ang Ⅱ組心肌細(xì)胞面積明顯大于AdGFP/Ang Ⅱ組(4 761±232vs3 520±407，n=20，P<0.05)(Fig 1)。

Fig 1 Effects of RGS6 overexpression on cardiomyocyte surface areas

與AdshRNA/PBS組相比，AdshRNA/Ang Ⅱ組細(xì)胞表面積明顯增加(1 899±94vs3 720±717，n=20，P<0.05)。AdshRGS6/Ang Ⅱ組與AdshRNA/Ang Ⅱ組相比細(xì)胞表面積降低(2 097±83vs3 720±717，n=20，P<0.05)(Fig 2)。提示RGS6會(huì)促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增加。

2.2 RGS6過表達(dá)/抑制表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)因子的影響Ang Ⅱ處理后，AdGFP/Ang Ⅱ組和AdRGS6/Ang Ⅱ組相比對(duì)照組AdGFP/PBS肌肥厚相關(guān)因子表達(dá)均明顯上調(diào)(ANP: 4.21±0.30vs1.02±0.07及6.41±0.42vs1.02±0.07，n=3，P<0.05；BNP：3.93±0.55vs0.95±0.05及5.33±0.32vs0.95±0.05，n=3，P<0.05)；與AdGFP/Ang Ⅱ 相比，AdRGS6/Ang Ⅱ組中ANP和BNP的表達(dá)均明顯增加，P<0.05(Fig 3)。

Fig 2 Effects of RGS6 knockdown-expression on cardiomyocyte surface areas

AdshRNA/Ang Ⅱ組相比對(duì)照組AdshRNA/PBS，ANP和BNP表達(dá)均明顯上調(diào)(4.33±0.32vs0.96±0.05，n=3，P<0.05；3.92±0.31vs0.97±0.05，n=3，P<0.05)；與AdshRNA/Ang Ⅱ 相比，AdshRGS6/Ang Ⅱ組中ANP和BNP的表達(dá)均明顯降低(4.33±0.32vs2.34±0.30，n=3，P<0.05；3.92±0.31vs1.79±0.18，n=3，P<0.05)(Fig 3)。結(jié)果表明RGS6會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)因子的表達(dá)。

Fig 3 Effects of RGS6 over/knockdown-expression on hypertrophic factors

2.3 RGS6過表達(dá)/抑制表達(dá)對(duì)信號(hào)通路的影響AdRGS6/Ang Ⅱ組和AdGFP/Ang Ⅱ組中ROS(5.77±0.22vs0.99±0.11、2.72±0.25vs0.99±0.11，n=3，P<0.05)和p-JNK1/2蛋白(2.17±0.06 vs 1.00±0.05、1.68±0.11vs1.00±0.05，n=3，P<0.05)均明顯高于對(duì)照組AdGFP/PBS，且差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與AdGFP/Ang Ⅱ組相比，AdRGS6/Ang Ⅱ組中ROS(2.72±0.25vs5.77±0.22，n=3，P<0.05)和p-JNK1/2蛋白(1.68±0.11vs2.17±0.06，n=3，P<0.05)明顯升高，p38和ERK1/2總蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)無差異(各組ROS含量如Fig 4，各組信號(hào)通路蛋白水平如Fig 5)。

Ang Ⅱ刺激48 h后，AdshRNA/Ang Ⅱ組ROS(3.16±0.15vs1.05±0.10，n=3，P<0.05)和p-JNK1/2蛋白(2.03±0.13vs1.02±0.08，n=3，P<0.05)明顯高于對(duì)照組AdshRNA/PBS，且差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與AdshRNA/Ang Ⅱ組相比，AdshRGS6/Ang Ⅱ組中ROS(3.16±0.15vs1.71±0.11，n=3，P<0.05)和p-JNK1/2蛋白(2.03±0.13vs0.71±0.07，n=3，P<0.05)水平明顯降低。(各組ROS含量如Fig 6，各組信號(hào)通路蛋白水平如Fig 7)。結(jié)果表明RGS6會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞中ROS和p-JNK1/2蛋白水平的增加，提示RGS6可能通過激活ROS/JNK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

Fig 4 Effects of RGS6 overexpression on reactive oxygen species(ROS) levels

2.4 ROS抑制劑干預(yù)后RGS6對(duì)心肌細(xì)胞肥大和信號(hào)通路的影響AdRGS6/DPI組心肌細(xì)胞表面積較AdRGS6/ DMSO組明顯降低(2 995±84vs4 670±288，n=20，P<0.05)。DPI處理后的AdGFP組和AdRGS6組，心肌細(xì)胞表面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2 889±84vs2 995±84，n=20，P<0.05)，表明抑制ROS水平可以降低RGS6過表達(dá)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞面積增加(Fig 8)。

Fig 5 Effects of RGS6 overexpression on MAPK signaling pathway

AdRGS6/DPI組的p-JNK1/2蛋白較AdRGS6/ DMSO組明顯降低(1.39±0.09vs2.13±0.06，n=3，P<0.05)，兩組間p-p38和p-ERK1/2蛋白差異無顯著性。DPI處理后的AdGFP組和AdRGS6組，p-JNK1/2蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.25±0.05vs1.39±0.09，n=3，P>0.05)(Fig 9)，表明抑制ROS水平可抑制其下游JNK1/2信號(hào)通路的激活，提示RGS6通過調(diào)控ROS/JNK1/2通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

3 討論

心肌肥厚是增加心血管疾病死亡率和發(fā)病率的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]。抑制心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展可明顯降低心衰等心血管疾病導(dǎo)致的死亡率。近年來，RGS家族因子作為G蛋白活性的調(diào)節(jié)因子備受關(guān)注，研究顯示其通過加速G蛋白的失活、阻斷G蛋白下游心肌細(xì)胞肥大相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用[5,12]。

Fig 6 Effects of RGS6 knockdown-expression on ROS levels

RGS6除具有RGS家族的G蛋白活性調(diào)節(jié)功能外，還具有細(xì)胞質(zhì)膜定位、調(diào)控G蛋白與跨膜受體解離等功能，因此RGS6具有G蛋白和非G蛋白雙重信號(hào)調(diào)節(jié)功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)RGS6通過調(diào)控ROS/JNK1/2信號(hào)通路來介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。我們的推斷思路為：與RGS其他家族因子相比，RGS6對(duì)心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用完全相反(RGS6促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大)，提示RGS6不是通過G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)作用介導(dǎo)心肌肥厚。相關(guān)文獻(xiàn)表明，RGS6在腫瘤疾病領(lǐng)域中能通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。而且，在心肌肥厚的相關(guān)機(jī)制中也存在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的相關(guān)反應(yīng)，再通過氧化應(yīng)激等作用刺激下游MAPK家族的成員，完成心肌細(xì)胞中整個(gè)肥大反應(yīng)過程。因此我們檢測(cè)了心肌細(xì)胞中ROS以及MAPK信號(hào)通路成員(JNK1/2、ERK1/2、p38)的表達(dá)，再通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide—adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶抑制劑降低ROS表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞肥大表型和下游MAPK家族的成員的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證RGS6通過調(diào)控ROS/JNK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

Fig 7 Effects of RGS6 knockdown-expression on MAPK signaling pathway

ROS是細(xì)胞內(nèi)一系列氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，近年來研究證明ROS可作為第二信使，參與心肌細(xì)胞肥大和凋亡、腫瘤細(xì)胞的增殖等多種信號(hào)的傳導(dǎo)。在心肌細(xì)胞中，ROS通過多重途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡，并且在心肌肥厚到心衰的病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)在肥大心肌細(xì)胞中 NADPH氧化酶活性增加且會(huì)激活敏感型激酶MAPK中的各亞家族，目前的眾多研究顯示心肌細(xì)胞中ROS主要通過觸發(fā)心肌肥厚相關(guān)的以下幾條通路發(fā)揮作用：① Ang Ⅱ激活的細(xì)胞MAPK信號(hào)通路[10]和NF-κB信號(hào)通路；② 腎上腺素和Ang Ⅱ激活的ERK1/2通路[14]；③ 機(jī)械刺激誘導(dǎo)的MAPK家族中各亞型變化[5]。綜合以上研究表明NADPH酶源性ROS在心肌細(xì)胞的肥大和凋亡中發(fā)揮重要作用，同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)RGS6過表達(dá)能增加心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放，促進(jìn)Ang Ⅱ刺激的心肌細(xì)胞肥大和心肌肥厚相關(guān)蛋白ANP、BNP的表達(dá)。關(guān)于ROS的下游信號(hào)通路，我們亦通過檢測(cè)MAPK家族成員總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ROS會(huì)調(diào)控下游JNK1/2蛋白的變化。

Fig 8 Effects of diphenyleneiodonium(DPI) on RGS6 overexpression cardiomyocyte surface

Twenty cells were measured for each group. DPI was the inhibitor of ROS, dimethyl sulfoxide(DMSO) was the control group.*P<0.05vsthe AdRGS6/DMSO group.

在心肌細(xì)胞肥大信號(hào)通路中，ROS-MAPK信號(hào)通路近年逐漸被重視。研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑如Ang Ⅱ和腎上腺素等與細(xì)胞膜上受體結(jié)合、刺激ROS的產(chǎn)生，從而參與激活MAPK家族成員。Guo等[15]研究發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞肥大過程中ROS/JNK1/2信號(hào)通路發(fā)揮重要作用?；谝陨涎芯繄?bào)道和我們的信號(hào)通路檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大病理過程中，RGS6通過激活ROS/JNK1/2信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。本研究為干預(yù)心肌細(xì)胞肥大的新靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于研究心肌肥厚的新型發(fā)病機(jī)制。

Fig 9 Effects of diphenyleneiodonium(DPI) on MAPK signaling pathway of RGS6 overexpression cardiomyocytes after Ang Ⅱ

The results are representative of three independent experiments. DPI was the inhibitor of ROS, and DMSO was the control group.*P<0.05vsthe AdRGS6/DMSO group. n.s. represents that there were no significant difference between the two groups.