自體移植的大鼠骨髓間充質干細胞在脊髓損傷處的存活及分化

沈忠杰，李 亮，吳石奇，廖文波

1.廣西壯族自治區第二人民醫院脊柱外科，桂林 541002

2.遵義醫科大學附屬醫院脊柱外科，遵義 563003

脊髓損傷（SCI）可造成損傷平面以下運動和感覺功能不同程度喪失[1-2］，損傷后脊髓微環境的改變可導致軸突回縮及再生低下[3］。雖然SCI 不會顯著影響患者壽命，但可能導致患者產生生理和心理問題，高昂的治療費用也給患者家庭及社會帶來沉重負擔[4］。SCI 的治療現仍是世界醫學難題[5］。目前干細胞移植治療SCI 已成為組織工程研究的熱點。骨髓間充質干細胞（BMSC）具有來源豐富、易于培養擴增、免疫排斥反應弱且在特定條件下可向神經細胞分化等優點[6-12］，是SCI 研究中比較理想的種子細胞。本研究采用改良Allen 撞擊裝置制備T9SCI 模型后，立即通過微量注射將自體BMSC 移植到損傷處，觀察自體移植的BMSC 存活及向神經細胞分化情況，為臨床應用自體BMSC 治療SCI 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

雄性SD 大鼠36 只，由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號:SCXK（渝）2017-0002。隨機分為PBS 注射組（PBS 組）和BMSC自體移植組（BMSC 組），每組18 只。主要試劑:L-DMEM培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（Hyclone，美國）；Ficoll-Paque 分離液（Pharmacia，美國）；胰蛋白酶、Hoechst33342、小鼠抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（Sigma，日本）；兔抗大鼠微管相關蛋白2（MAP-2）多克隆抗體（Abcam，英國）；羊抗小鼠FITC-IgG 及羊抗兔TRITC-IgG（武漢博士德公司，中國）；抗大鼠CD29、CD45、CD90 單克隆抗體（BioLegend，美國）。

1.2 BMSC 的分離培養、鑒定及標記

用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用脫毛劑對大鼠后肢進行脫毛處理，之后進行嚴格消毒鋪巾。在無菌條件下，用裝有肝素鈉生理鹽水的注射器從雙側大鼠股骨處抽取骨髓液，得到混有肝素生理鹽水的骨髓液1.5 ～ 2.0 mL，之后加入10.0 mL PBS 混勻，1 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心5 min 后棄上清；沉淀物用5 mL L-DMEM 液重懸后緩慢疊加到等量的Ficoll-Paque 分離液上層，2 000 r/min（離心半徑為6 cm）離心20 min；收集單核細胞層，即為BMSC。用含10%胎牛血清的L-DMEM 重懸后按3×104/mL 的密度接種于底面積為25 cm2的培養瓶中，細胞接近70%融合時進行傳代。用流式細胞術檢測第4 代BMSC 細胞膜抗原CD90、CD29、CD45。待第4 代BMSC 接近80%融合時，按照謝興文等[13］的方法使用終濃度為5 μg/mL的Hoechst33342 避光孵育30 min，消化、離心后收集細胞，制成細胞密度為5×106/mL 的細胞懸液，4℃保存備用。待建立SCI 模型（用時15 ～ 20 min）后立即進行自體移植。

1.3 SCI 模型的建立及細胞移植

36只SD大鼠均用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉生效后俯臥位固定，術區消毒、鋪巾，以T9棘突為中心做1個長約4 cm的切口，暴露T8～10棘突和椎板，咬除T9棘突和椎板以暴露該節段的脊髓，采用改良Allen法[14］（40 g重物自5 cm高度垂直打擊）制備SCI模型。評價造模成功的標準[15］:大鼠雙后肢及軀體回縮樣撲動后雙后肢癱瘓，尾部出現痙攣性擺動，局部脊髓表面迅速水腫并淤血。

建立模型后，即刻使用微量注射器在BMSC 組大鼠損傷中心處微量注射細胞懸液5 μL，PBS 組在相同位置注射等量PBS。注射過程應盡量緩慢。徹底止血后依次縫合肌肉、皮下、皮膚。術后2 周內因協助排尿膀朧破裂死亡及術區感染死亡大鼠各2 只，均予補齊進行實驗。在術后2、3、5 周采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法[16］對大鼠雙后肢運動功能恢復情況進行評分。

1.4 脊髓標本的制備

每組分別于移植后2、3、5周各取6只大鼠，用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，用300 mL預冷4%多聚甲醛經左心耳灌注固定（灌注速度宜先快后慢），切取以T9損傷處為中心、向頭尾端共長1 cm 的脊髓，于4℃ 4%多聚甲醛中固定12 h 后進行連續冠狀冰凍切片，片厚10 μm，每隔4 張取1張，每個標本各留取40 張。切片直接貼于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上，置于暗盒-20℃保存。

1.5 損傷處BMSC 存活計數

BMSC 組每只大鼠移植后2、3、5 周各取5 張切片，在熒光顯微鏡下（400 倍），在每張切片的細胞移植區隨機選取2 個視野，計數每只大鼠10 個視野中被Hoechst33342 標記的BMSC 總數，取其均值作為BMSC 組每只大鼠每個視野BMSC 存活數量。計數時以發藍色熒光、呈橢圓形或圓形、大小較均一的細胞核作為存活BMSC 的細胞核。

1.6 損傷處BMSC 分化情況及組織學變化

BMSC組每只大鼠移植后2、3、5周各取5張切片，室溫復溫10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入體積分數為3%的H2O2作用10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入體積分數為0.3%的TritonX-100 作用30 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；滴加10%正常山羊血清室溫封閉30 min，甩掉血清；分別滴加稀釋的小鼠抗大鼠GFAP 單抗（1∶400）及兔抗大鼠MAP-2 多抗（1∶200）一抗，4℃濕盒中過夜，用0.01 mol/L PBS 清洗3 次，每次5 min；分別滴加稀釋的羊抗小鼠IgG-FITC（1∶64）及羊抗兔IgG-TRITC（1∶64）二抗，濕盒中37℃孵育1 h，用0.01 mol/L PBS 清洗2次，每次5 min；用抗熒光衰減劑封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。細胞核發藍色熒光、胞質發紅色熒光的細胞表示移植存活的BMSC 分化為神經細胞，細胞核發藍色熒光、胞質發綠色熒光的細胞表示移植存活的BMSC 分化為星形膠質細胞。

于移植后2、3、5 周，取BMSC 組和PBS 組大鼠脊髓組織切片進行HE 染色，觀察脊髓組織學變化。1.7 統計學處理

采用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料以s 表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；以P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSC 分離培養及鑒定

分離的細胞接種24 h 內逐漸貼壁，72 h 后貼壁細胞增多，細胞形態以長梭形和多角形為主（圖1a）。隨著培養時間的延長，大部分貼壁細胞伸展開，邊緣伸出較長的突起，與周圍細胞相連接，至第5 天時細胞數量明顯增多，有形成細胞集落的趨勢，細胞形態以短梭形為主（圖1b）。流式細胞術檢測提示第4 代BMSC 細胞膜抗原CD90、CD29 表達陽性，CD45 表達陰性（圖2），表明分離培養的目標細胞主要是BMSC。

圖1 BMSC 形態學觀察（×100）Fig. 1 Morphology of BMSC（×100）

圖2 流式細胞術檢測第4 代BMSC 表面標志物的表達Fig. 2 Flow cytometry detecting expression of surface markers of 4th generation BMSC

2.2 移植后各時間點2組大鼠BBB 評分的比較

移植后2、3、5 周，BMSC 組大鼠BBB 評分均高于PBS 組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05，表1）。

2.3 BMSC 在損傷處的存活和分化情況

熒光顯微鏡下可觀察到BMSC 組大鼠損傷處脊髓有不同數量Hoechst33342 標記的細胞存活，移植后2、3、5 周BMSC 存活數量分別為40.58±6.67、25.32±4.34、7.56±4.13，其中2 周時細胞存活較多，5 周時細胞存活較少。移植后2、3 周時未檢測到BMSC 組大鼠損傷處移植存活的BMSC MAP-2及GFAP 免疫反應陽性，而在5 周時檢測到少量移植存活的BMSC MAP-2 及GFAP 免疫反應陽性（圖3）。

表1 移植后各時間點2組大鼠BBB 評分Tab. 1 BBB scores in 2 groups at each time point after transplantation

表1 移植后各時間點2組大鼠BBB 評分Tab. 1 BBB scores in 2 groups at each time point after transplantation

注:*與PBS 組比較，P ＜ 0.05。Note:* P ＜ 0.05，compared with PBS group.

圖3 移植后BMSC 在損傷處的存活和分化情況（×400）Fig. 3 Survival and differentiation of BMSC in SCI site after transplantation（×400）

2.4 2 組損傷處脊髓組織學變化

HE 染色結果顯示，PBS 組大鼠注射后2 周，損傷處脊髓組織結構紊亂明顯，神經細胞變性壞死，有較多炎性細胞浸潤；注射后5 周，脊髓有明顯的空洞及膠質瘢痕形成。BMSC 組大鼠移植后2 周，損傷處脊髓組織結構較規整，輕度充血水腫，神經細胞渾濁但未見變性和壞死，有少量炎性細胞浸潤；移植后5 周，脊髓無明顯的空洞形成，有少量膠質瘢痕形成（圖4）。

圖4 2 組大鼠損傷處脊髓組織學變化（HE染色，×200）Fig. 4 Histological changes of SCI site in 2 groups（HE staining，×200）

3 討 論

作為組織工程的種子細胞，BMSC 在細胞替代治療、基因治療以及組織器官的再造中具有重要的研究意義及臨床應用價值，被廣泛應用于組織工程研究中[17-18］。Hofstetter 等[19］于大鼠SCI 1 周后對損傷處脊髓進行BMSC 移植，5 周后觀察到少許移植細胞表達神經元標志物NeuN，通過BBB 評分及組織學檢測證明BMSC 移植后可在一定程度上改善SCI 后截癱動物的預后。Huang 等[20］在大鼠SCI 1 周后于損傷處脊髓移植BMSC 和神經生長因子混懸液，2 個月后觀察到植入損傷部位的BMSC 不僅能夠分化為神經元和星形膠質樣細胞，而且表達神經元和星形膠質細胞的蛋白標志物NeuN 和GFAP，并在SCI 部位形成細胞導向引導神經纖維的再生，起到橋接作用，使再生的神經軸突可以順利地通過損傷處。陳秉耀等[21］在大鼠損傷脊髓處注射異體BMSC，結果發現在損傷處存活下來的細胞中有少量細胞表達神經元標志物MAP-2或星形膠質細胞標志物GFAP。高瑞等[22］將GFP 轉基因大鼠的BMSC異體移植于SCI 大鼠體內，通過體內示蹤和免疫熒光共定位發現，外源性BMSC 能聚集于SCI 部位并分化為神經元、神經膠質細胞和神經前體細胞。Ye等[23］的研究發現，在體外誘導BMSC 向神經細胞分化后，再移植到大鼠損傷脊髓處，能促進損傷脊髓修復。上述異體移植BMSC 的實驗研究表明，BMSC移植于中樞神經系統損傷處后，部分移植細胞可存活并有少量細胞表達神經元和星形膠質樣細胞標志物，并在一定程度上改善SCI情況。本研究在建立大鼠SCI模型后立即在損傷部位移植自體BMSC，移植后2、3及5周在損傷處脊髓均觀察到移植細胞存活，并且BMSC自體移植組BBB評分均高于PBS注射組，顯示部分移植的BMSC能在SCI后不利的局部微環境下存活，對SCI后運動功能的恢復有一定作用。

本研究結果顯示，移植細胞于2周時存活較多、5 周時存活較少，提示自體移植的BMSC 在損傷脊髓內存活的數量隨著時間的延長而減少。分析其原因:①標記細胞的Hoechst33342 熒光染料隨著細胞分裂其熒光強度逐漸遞減或消失[24］；②SCI 2 周后，損傷處仍可見炎性細胞浸潤，而炎性細胞所分泌的一些有害細胞因子可使前期存活下來的BMSC死亡；③SCI 5 周時，損傷處及其附近形成少量的瘢痕組織及空洞，會造成局部血供不足，影響了BMSC 的存活；④術后大鼠進食欠佳，至術后5 周時大鼠極為消瘦，營養不良亦會影響BMSC的存活。

在BMSC 移植后第5 周，采用免疫熒光染色法檢測到少量的移植細胞表達MAP-2 及GFAP，這說明移植細胞在局部微環境作用下，存活的BMSC 可向神經元和星形膠質樣細胞方向分化。但目前尚無證據證實這些分化細胞就是功能成熟的細胞。有學者認為，MAP-2 及GFAP 等標志物并非是神經元和星形膠質樣細胞的特異性標志物，因為發育過程中的肌纖維和心肌細胞等非神經細胞亦可表達這些標志物[25］。目前的實驗研究大多停留在分化的BMSC具有神經元或星形膠質樣細胞的形態特征和表達神經元或星形膠質樣細胞的特異性標志物這一層面，而缺少具有神經元或星形膠質樣細胞的結構和電生理學特征的證據。本實驗亦缺少這方面的證據，故不能證實這些分化細胞就是功能成熟的細胞。至于這些分化后的細胞能否真正有效地取代受損的神經元、促進神經纖維的再生進而促進大鼠脊髓功能的恢復，需進一步的實驗研究予以闡明。

目前，關于SCI 后BMSC 移植時機的選擇尚未達成共識。本研究選擇在SCI 后立即進行BMSC 移植，能避免SCI 后一段時間進行局部移植BMSC 再次麻醉的不良作用及再次手術的打擊，保證大鼠的存活率，利于后續實驗的進行；且在SCI 后急性炎性反應期進行移植可能通過改善損傷后脊髓的內部環境阻斷某些惡性循環，分泌有利神經再生的因子，填充損傷脊髓區域的空腔，從而減輕SCI 早期出現的大量神經細胞凋亡及減輕脊髓繼發性損傷，加速大鼠后肢功能的恢復[26-28］。在此基礎上，后續實驗擬對比SCI 后在損傷處脊髓即刻移植BMSC，與損傷后3、7 及14 d 移植BMSC 的結果進行對比，進一步摸索自體BMSC 移植治療SCI 的最佳時機。

本研究結果顯示，僅少量存活細胞分化為神經細胞，而多數存活的細胞是否分化為其他細胞，并且這些細胞對損傷脊髓功能的修復起到促進還是阻礙的作用，這些問題有待進一步深入研究。本研究通過對細胞移植5 周后的損傷處脊髓組織進行HE染色，觀察到BMSC 移植組損傷處脊髓有少量膠質瘢痕組織形成，推測這些膠質瘢痕組織可能是由BMSC 分泌的類膠原細胞外基質形成的，提示存活下來的BMSC 可向結締組織方向分化，這一推測有待進一步實驗研究予以證實。