訶子鞣質與一線二線抗結核藥物聯合對耐藥性結核分枝桿菌活性研究

宋青山 賈芳

[摘? ? ? ? ? ?要]? 從臨床分離得到439株MDR菌株，得到38株XDR菌株。訶子鞣質對敏感株的抑菌濃度為50μg/mL～100μg/mL， 訶子鞣質對MDR、XDR菌株的抑菌濃度為50μg/mL～200μg/mL。訶子鞣質與三種一線抗結核藥物中任意一種聯合作用于MDR的協同效果顯著高于XDR。訶子鞣質與三種二線抗結核藥物中任意一種聯合作用于MDR的協同效果顯著高于XDR。

[關? ? 鍵? ?詞]? 訶子鞣質;結核分枝桿菌;抗結核藥物

[中圖分類號]? R52? ? ? ? ? ? ? ?[文獻標志碼]? A? ? ? ? ? ?[文章編號]? 2096-0603（2020）44-0086-03

結核病仍然是一個世界公共衛生問題，全世界每年大約有900萬新增病例[1]。

尤其是廣泛耐藥結核病（XDR-TB）的出現，給全球結核病控制帶來了極大的挑戰。

研究報道中藥或中藥提取物或中藥制劑聯合標準化抗結核化療治療耐多藥結核分枝桿菌取得了一定進展，在茜草素聯合標準抗結核化療方案治療耐多藥肺結核協同作用的研究中發現，茜草素對人型結核分枝桿菌標準菌株（H37RV）最低抑菌濃度為80ug/mL，聯合西藥時顯示出對耐藥菌株抑殺作用，而又不表現出傷肝的缺點[2]。訶子（Terminalia chebula Retz）是君子科植物訶子成熟的果實，是蒙藥、藏藥中的最常用藥[3]。本研究為進一步研究訶子鞣質抗結核分枝桿菌活性提供試驗數據，在臨床治療耐藥結核病中提供理論指導。

一、材料與方法

（一）藥物

一線二線抗結核藥物購于銀科醫學工程股份有限公司。訶子鞣質購于中國標準物質。

（二）菌株

菌株分離于2016年11月—2017年7月北京胸科醫院國家結核病臨床實驗室確診的住院結核分枝桿菌培陽的結核患者痰液。

（三）方法

1.單獨藥敏試驗

藥敏試驗按照中國防癆協會《結核病檢驗細菌學檢驗規程》，采用WHO推薦的微孔板法，進行16種（包括抗結核一線和二線藥物）抗結核菌藥敏實驗組套。接種菌懸液的制備：挑取一菌環菌體于Middlebrook 7H9液體培養基中并研磨，1：20稀釋后使用。用MABA法（阿爾馬蘭法）與Middlebrook 7H9液體培養基二倍稀釋法測定訶子鞣質或者抗生素類藥物對人型結核分枝桿菌標準菌株（H37RV）、敏感株、MDR、XDR菌株的最低抑菌濃度[4]。判定方法為粉紅色記錄為陽性生長孔。最低抑菌濃度（MIC）定義為阻止顏色變為粉紅色的最低藥物濃度。

2.聯合藥敏試驗

聯合藥用的方法采用棋盤法。利用部分抑菌濃度指數（fractional? inhibitory concentration index，FICI） 判定聯合用藥效果，FICI=（MICa聯合/MICa單獨）+（MICb聯合/MICb單獨），FICI≤0.5，兩者協同;0.5﹤FIC≤1，兩者不相關;FIC>1，兩者拮抗。

（四）統計方法

針對XDR-TB患者一線二線抗結核藥物耐藥情況各組分間的差異用卡方檢驗或Fisher′確切值檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

（一）敏感株、MDR、XDR菌株的篩選

在此次藥敏試驗中一共收集到敏感株2494株，MDR菌株439株，XDR菌株38株。其中XDR菌株中耐藥卡那霉素有13例，卷曲霉素有10例，阿米卡星有16例，里面包括同時耐卡那霉素和卷曲霉素5例，同時耐卡那霉素、卷曲霉素和阿米卡星2例。

（二）訶子鞣質對敏感株、MDR、XDR菌株的敏感性

訶子鞣質對敏感株的抑菌濃度為50μg/mL～100μg/mL，訶子鞣質對MDR、XDR菌株的抑菌濃度為50μg/mL～200μg/mL。

（三）訶子鞣質聯合一線抗結核藥物藥敏分析

訶子鞣質聯合INH、RFP和SM作用于結核分枝桿菌標準株H37Rv（ATCC 27294）和8株MDR、XDR的體外協同抗菌活性作用效果（見表2）。訶子鞣質聯合INH、RFP和SM作用于4株MDR均具有協同作用，且MIC值顯著下降。與訶子鞣質聯合后，INH的MIC值下降8～32倍（FICIs 0.250-0.375）、RFP的MIC值下降1～4倍（FICIs 0.240-0.375）、SM的MIC值下降1～4倍（FICIs 0.165-0.275）。訶子鞣質對結核分枝桿菌標準株H37Rv和XDR的聯合藥敏結果表明，它們之間不相關，FICIs為0.562～1.063。研究發現，當訶子鞣質與三種抗結核藥物中任意一種聯合作用于MDR的協同效果顯著高于XDR。

（四）訶子鞣質聯合二線抗結核藥物藥敏分析

訶子鞣質聯合Km、Cm和Am作用于結核分枝桿菌標準株H37Rv（ATCC 27294）和8株MDR、XDR的體外協同抗菌活性作用效果（見表2）。訶子鞣質聯合Km、Cm和Am作用于4株MDR均具有協同作用，且MIC值顯著下降。與訶子鞣質聯合后，INH的MIC值下降4～16倍（FICIs 0.250～0.375）、RFP的MIC值下降2～4倍（FICIs 0.281～0.375）、SM的MIC值下降1～2倍（FICIs 0.253～0.321）。訶子鞣質對結核分枝桿菌標準株H37Rv和XDR的聯合藥敏結果表明，它們之間不相關，FICIs為0.562～1.063。研究發現，當訶子鞣質與三種抗結核藥物中任意一種聯合作用于MDR的協同效果顯著高于XDR。

三、討論

結核病也是我國重點控制的慢性呼吸道傳染病之一。經過短程督導治療大多數肺結核患者是可以治愈，但是耐多藥的結核菌出現給臨床的治療帶來了極大的困難。耐多藥結核病（MDR-TB）是至少同時耐利福平和異煙肼的結核病[5];對于MDR-TB患者還需要使用二線抗結核藥物，但近年來，在MDR-TB的基礎上，又出現了對氟喹諾酮類藥物和至少對包括（卡那霉素、卷曲霉素、阿米卡星）三種二線抗結核注射類藥物一種耐藥的廣泛耐藥結核病（XDR-TB）[6]。然而XDR-TB的出現給全球結核病控制帶來了極大的挑戰。訶子在蒙藥中的應用比例最大，功用最廣泛，被稱為“蒙藥之王”。訶子對革蘭陽性和革蘭陰性細菌均有抑制作用。訶子的乙醇提取物對耐甲氧嘧啶（SXT）/磺胺甲唑（TMP）的大腸桿菌的抗菌活性效果很好[7];訶子的果實提取物沒食子酸及其乙酯對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用，訶子的酸性乙醚提取物和乙醇提取物均具有一定的抗真菌活性[8]，對生物被膜的形成也有抑制作用[9];訶子在體內、外均能抑制阿昔洛韋耐藥的單純性皰疹病毒;同時，訶子具有一定的抗瘧原蟲和抗阿米巴原蟲活性[10]。可見，訶子及其提取物對細菌、真菌、寄生蟲及其病毒均有抵抗作用。中藥訶子鞣質與INH、RFP和SM聯合發現有較好抗結核分枝桿菌藥理活性，且在MDR中能發揮出兩者聯用的協同作用。

參考文獻：

[1]Alice L，Martín M，Rachel L.et al.Cytokine Kinetics in the First Week of Tuberculosis Therapy as a Tool to Confirm a Clinical Diagnosis and Guide Therapy[J].PLOS ONE，2015，26（6）：1-15.

[2]丁汀，劉偉，徐金田，等.茜草素聯合抗結核西藥對耐多藥結核分枝桿菌體外抗菌活性研究[J].中華醫院感染學雜志，2016，26（18）：4107-4109.

[3]張海龍，裴月湖，華會明.訶子化學成分及藥理活性的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2001，6（19）：452-455.

[4]邢立群，賈芳.甘草次酸聯合抗結核藥對結核桿菌活性研究[J].中國畜牧獸醫2014，41（4）：160-164.

[5]李靜，沈鑫，張陽奕，等.上海地區MDR-TB患者二線藥物耐藥危險因素分析[A].2011年中國防癆協會全國學術會議論文集[C]，2011.

[6]Abubakar I，Moore J，Drobniewski F，etal.Exten-sively drug resistant? tuberculosis in the UK：1995 to 2007[J].Thorax，2009，64（6）：512-515.

[7]Malekazadeh F，Ehsasnifar H，Shahamat M.Anti-

bacterial activity of black myrobalan（Terminalia chebula Retz）against Helicobacter pylori[J].Internation journal of antimicrobial Agents，2001（18）：85-88.

[8]Sato Y，Oketani H，Singyouchi K.Extraction and purification of effective antimicrobial constiuents of Term-

inalia chebula REtS against methicillinresistant Staphy-lococcus aureus[J].BiolPharm Bull，1997，20（4）：401.

[9]向麗，周鐵軍，葉迎春，等.訶子鞣質對白色念珠菌及其生物被膜的影響[J].重慶醫學，2013，42（2）：134-137.

[10]Pinmai K，Hiriote W，Soonthornchareonnon N，etal.Invitro and in vivo anti Plasmodial activity and cytotoxicityof water extracts of Phyllanthus emblica，Terminalia chebula，and Terminalia bellerica[J].J Med Assoc Thai，2010，93（Suppl7）：S120.

◎編輯 曾彥慧