土荊芥種子總黃酮提取條件的優化和抗腫瘤活性評價

郝俊玫，王亞男，錢瑞華，李海贏，武靖松，馬丹煒

四川師范大學生命科學學院，成都 610101

土荊芥(C.ambrosioides)為藜科一年或多年生草本植物[1]，廣泛分布于世界溫帶至熱帶地區，在我國南方和北方的大部分地區均有分布[2]。土荊芥全株含有豐富的揮發油、黃酮、生物堿等，具有抗菌、抑蟲、抗腫瘤和抗氧化等功效[3,4]。在抗腫瘤方面，土荊芥葉醇提物可抑制腹腔內艾氏固體瘤和腹水瘤的形成，顯著提高荷瘤小鼠存活率[5]；全株醇提物可抑制MCF-7細胞增殖[6]；在土荊芥的不同器官中，所含黃酮類物質成分差異較大，從種子中提取的次生代謝產物含量高于根和莖[7,8]。

在植物次生代謝物質的提取方面，提取溶劑對提取物的成分影響較大，對其抗腫瘤活性方面影響也較大。Zeng等[9]研究長根靜灰球不同溶劑提取物的體外抗腫瘤作用，發現正丁醇提取物對MDA-MB-231細胞活力有較明顯的抑制作用；不同溶劑海芋提取物抗腫瘤效果也不盡相同，乙酸乙酯和丙酮提取物有較好的細胞毒活性，而海芋的環己烷、石油醚、乙醇和水提物對各種細胞株的IC50劑量都比較大[10]。有關不同溶劑對土荊芥提取物成分及其抗腫瘤活性成分的影響報道較少，本研究選用不同極性有機溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及蒸餾水單獨或依次為溶劑，采用微波超聲波組合合成/萃取儀提取四川產土荊芥種子總黃酮，采用HPLC法測定其槲皮素和山奈酚的含量，MTT法評價其抗腫瘤活性，以期篩選土荊芥種子總黃酮最佳提取條件，為四川產土荊芥作為潛在抗腫瘤藥物的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

土荊芥于2016年9月下旬在四川省成都市凈居寺的廢棄荒地采集，經四川師范大學生命科學學院馬丹煒教授鑒定為藜科藜屬植物土荊芥(C.ambrosioides)。將采集的土荊芥植株置于陰涼通風處，曬干后收集其種子，磨碎放于密封袋中備用。

人正常肝L02細胞、人宮頸癌Hela細胞、人肝癌HepG2、Hep3b細胞、SMMC-7721和人結腸癌HT29細胞均由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室提供。

1.2 儀器與試劑

祥鵠電腦微波超聲波組合合成/萃取儀(北京祥鵠科技發展有限公司)；Algilent Technologies高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(成都科龍化工試劑廠)；槲皮素、山奈酚(西安天美生物科技公司)；噻唑藍(MTT，Biosharp生物公司)；5-氟尿嘧啶(中國食品藥品檢定研究院)；鬼筆環肽(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.3 土荊芥種子總黃酮的制備與純化

稱取40 g土荊芥種子，按料液比1∶6加入溶劑，浸泡1 h，微波為300 Hz，超聲波為275 Hz，微波與超聲波比例為1∶2。其它條件如表1所示，得到S1～S7提取物。采用D101大孔吸附樹脂純化S1～S7提取物，收集液再次用旋轉蒸發儀減壓蒸餾，并進行真空干燥。

表1 土荊芥種子總黃酮提取方法

注：S1:石油醚提取物；S2:乙酸乙酯提取物；S3:正丁醇提取物；S4:蒸餾水提取物；S5:石油醚-乙酸乙酯依次提取物；S6:石油醚-乙酸乙酯-正丁醇依次提取物；S7:石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-蒸餾水依次提取物，下同；“+”使用該溶劑提取；“-”表示不使用該溶劑提取。

Note:S1:Petroleum ether extract;S2:Ethyl acetate extract;S3:Butyl alcohol extract;S4:Distilled water extract;S5:Petroleum ether-ethyl acetate sequential extract;S6:Petroleum ether-ethyl acetate-butyl alcohol sequential extract;S7:Petroleum ether-ethyl acetate-butyl alcoho-distilled water sequential extract.

1.4 土荊芥種子總黃酮含量測定

1.4.1 標準溶液制備和標準曲線的確定

按Qian等[3]的方法配置標準溶液，按照紫外-可見分光光度法，在波長510 nm測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，作標準曲線圖。

1.4.2 樣品總黃酮含量測定

分別稱取純化后的S1～S7提取物各0.2 g，配制濃度為2 mg/mL的母液。量取上述各樣品母液1 mL，同“1.4.1”中蘆丁標準溶液的配制方法，按照紫外-可見分光光度法，在波長510 nm處測定其吸光度值，并根據線性回歸方程計算各樣品中總黃酮類物質含量[3]。

1.5 土荊芥種子總黃酮中槲皮素和山奈酚含量測定

1.5.1 標準品溶液的配制和線性曲線的確定

以甲醇為溶劑，配制濃度為200 μg/mL的槲皮素標品母液和300 μg/mL的山奈酚標品母液，備用。兩種標品溶液的配制見表2。

表2 槲皮素和山奈酚標品溶液濃度

將0.1%甲酸用抽濾泵經有機濾膜抽濾后放入超聲波清洗儀中進行脫氣，以相同的方法處理100%乙腈。然后分別用0.1 %甲酸、100%乙腈沖柱，流速為3.00 mL/min，再用100%乙腈沖基線至平滑。

按以下色譜條件進樣：C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；進樣量為10 μL；柱溫為25 ℃；乙腈-0.1%甲酸(35∶65)作為流動相，柱流量為1.0 mL/min；在波長為360 nm處進行檢測。以峰面積為縱坐標(Y)，對應濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸計算，得其回歸方程[11]。

1.5.2 樣品總黃酮溶液的配制

分別稱取純化后的S1～S7提取物，用溶液配制濃度為200 mg/mL的溶液。進樣的色譜條件同“1.5.1”中槲皮素和山奈酚標準溶液的檢測方法，在波長360 nm處測定其對應峰面積值，并根據線性回歸方程計算各樣品中槲皮素和山奈酚的物質含量[12]。

1.6 細胞培養

L02、SMMC-7721、HepG2、Hep3b、Hela和HT29細胞分別接種在加有10%新生牛血清的改良型1640培養基或DMEM培養基中，在5% CO2、37 °C培養箱中培養。取對數生長期細胞用于試驗。

1.7 MTT法檢測細胞增殖

制備上述6株細胞的細胞懸液，以濃度8×104個/mL、每孔100 μL接種于96孔板中。在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，每孔加100 μL新鮮培養基，按照表3加入2 μL不同濃度的土荊芥種子提取物溶液。各濃度重復5次，設置溶劑對照(1% DMSO)、陰性對照和陽性對照(80 μg/mL 5-氟尿嘧啶)。共培養24 h后，加入20 μL MTT培養4 h，除上清，加150 μL DMSO。酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度A值，計算細胞增殖抑制率(細胞增殖抑制率=[1-A處理組/A溶劑對照]×100%)。

表3 各樣本處理濃度

注：對照組：1% DMSO；S1～S7同表1。

Note:Control:1% DMSO;S1-S7 are the same as Table 1.

1.8 倒置顯微鏡觀察細胞形態

制備濃度為4×105個/mL的SMMC-7721細胞的細胞懸液，以每孔1 mL接種在6孔板上。5% CO2、37 ℃培養箱中培養過夜后，每孔加1 mL新鮮培養基，并加入20 μL S6溶液，使其終濃度分別為0.1、0.3和0.7 mg/mL，并設置溶劑對照(1% DMSO)。培養24 h后，用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.9 細胞集落形成試驗

前期SMMC-7721細胞的培養和不同濃度S6溶液的處理方法同“1.8”，同時設置溶劑對照(1% DMSO)。各濃度的S6溶液作用SMMC-7721細胞后，孵育至明顯觀察到細胞集落，除上清，PBS清洗，2.5%戊二醛溶液固定20 min，PBS清洗3次，Giemsa染液染色30 min，PBS清洗6孔板直至完全脫色后，倒置顯微鏡觀察，并拍照。

1.10 熒光顯微鏡觀察細胞骨架

SMMC-7721細胞的培養和不同濃度S6溶液的處理方法同“1.8”，并設溶劑對照(1% DMSO)。各濃度的S6溶液作用SMMC-7721細胞24 h后，棄去培養基，用PBS清洗后，每孔加濃度為1%的Triton X-100/M緩沖液1 mL，在25 ℃下靜置20 min；棄去Triton X-100/M緩沖液，再次用PBS清洗10 min，重復3次；2.5% 的戊二醛固定(4 °C、15 min)，再次用PBS清洗3次；200 μM鬼筆環肽染色20 min，PBS重復清洗3次后，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.11 統計分析

采用SPSS 20.0處理數據，單因素ANOVA方差分析顯著性差異(P<0.05)，使用Microsoft Excel 2003和GraphPad Prism 7.04作圖。

2 結果與分析

2.1 土荊芥種子提取物總黃酮提取率及含量測定

選用不同極性溶劑，采用微波超聲波輔助萃取土荊芥種子總黃酮，D101大孔吸附樹脂純化粗提物，最后得率見表4，S6的提取率最高為3.97%，S1的提取率最低為0.28%。黃酮的標準曲線見圖1，其回歸線方程為Y= 0.005 8X-0.000 4，R2=0.999 9，線性范圍為0～50 μg/mL。S1～S7中總黃酮含量見表4，S6中總黃酮含量最高為96.39 mg/g。

2.2 土荊芥種子總黃酮中槲皮素和山奈酚含量分析

采用高效液相色譜儀對梯度稀釋后的不同濃度槲皮素和山奈酚標品溶液進行分析，槲皮素和山奈酚標準曲線分別如圖2(A)和2(B)所示，并根據濃度和峰面積計算線性回歸方程，槲皮素標品的線性回歸方程為Y=35.188 79X-2.886 93e-1，相關性R2=0.999 94，殘留標準誤差為3.036 39，出峰保留時間為6.940 min；山奈酚標品的線性回歸方程為Y=14.957 23X-4.291 25，相關性R2= 0.999 94，殘留標準誤差為3.778 41，出峰保留時間為11.756 min。

表4 不同溶劑土荊芥種子總黃酮的提取率及含量

圖1 黃酮標準曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids

如表5結果所示，S1～S7中槲皮素和山奈酚的含量不同。S2中槲皮素含量最高為0.602 mg/g，S6中槲皮素含量次之，為0.531 mg/g，S5和S3中槲皮素含量分別為0.481和0.412 mg/g；S6中山奈酚的含量最高，為0.479 mg/g。而S1、S4和S7樣品中未檢測到槲皮素和山奈酚的成分。

2.3 土荊芥種子總黃酮對6株供試細胞增殖的抑制作用

MTT法檢測S1～S7對各細胞的抑制效果及IC50值見圖4和表6。綜合來看，當分別用S1～S7作用于細胞24 h時，S1～S7均不同程度的抑制6株供試細胞的增殖，且具有濃度依賴性(P< 0.05)。其中S2、S5和S6抗腫瘤作用優于其余4種。S6對Hela、SMMC-7721和HepG2 細胞的增殖抑制效果較強，IC50值分別為0.37、0.43和0.66 mg/mL，對人正常肝細胞L02幾乎沒有抑制作用。因S2和S5的溶解效果較差，故本研究后續試驗中均選S6即土荊芥種子石油醚-乙酸乙酯-正丁醇提取物(petroleum ether-ethyl acetate-n-butanol extract ofC.ambrosioidesseeds)進行抗腫瘤作用研究。

圖2 槲皮素(A)和山奈酚(B)標準曲線Fig.2 Standard curve of quercetin (A) and kaempferol (B)

圖3 槲皮素和山奈酚含量測定的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram of determination of quercetin and kaempferol注：S1～S7同表1；A:槲皮素標品；B:山奈酚標品；C:S2；D:S3；E:S5；F:S6；1:槲皮素；2:山奈酚。Note:S1-S7 are the same as table 1;A:Standard product of quercetin;B:Standard product of kaempferol;C:S2；D:S3；E:S5；F:S6;1:Quercetin;2:Kaempferol.

圖4 S1～S7對L02、Hela、SMMC-7721、Hep3b、HepG2和HT29細胞增殖的影響Fig.4 Effects of S1-S7 on proliferation of L02,Hela,SMMC-7721,Hep3b,HepG2 and HT29 cells注：S1～S7同表1；0 mg/mL：1% DMSO對照；*表示顯著差異(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: S1-S7 are the same as table 1; Control of 1% DMSO; *represents difference P<0.05; **represents highly dominant difference P<0.01.

表5 土荊芥種子提取物中槲皮素及山奈酚含量

表6 S1～S7對6株細胞的IC50值(mg/mL)

注：S1～S7同表1；“-”表示無抗腫瘤作用。

Note:S1-S7 are the same as Table 1;“-” means no antitumor effect.

2.4 S6對SMMC-7721細胞形態變化的影響

溶劑對照組的SMMC-7721細胞呈舒展狀貼壁生長，有明顯的細胞分裂相出現(圖5a)；隨著S6處理濃度的增大，SMMC-7721細胞形態、粘附性和折光性均發生變化，細胞粘附力下降，逐漸開始皺縮變圓，高劑量組大部分細胞懸浮死亡(圖5b～d)。表明S6對SMMC-7721細胞具有顯著的細胞毒性。

圖5 S6對SMMC-7721細胞形態的影響Fig.5 Effect of S6 on the morphology in SMMC-7721 cells注：a：1% DMSO對照；b：0.1 mg/mL S6；c：0.3 mg/mL S6；d：0.7 mg/mL S6，下同。Note:a:control of 1% DMSO;b:0.1 mg/mL of S6;c:0.3 mg/mL of S6;d:0.7 mg/mL of S6,the same below.

2.5 S6對SMMC-7721細胞集落形成的影響

SMMC-7721細胞集落形成試驗是通過觀察結晶紫的染色程度來作為評判標準的，結果顯示，S6濃度越高，結晶紫染色越淺，表明SMMC-7721細胞形成的集落數越少(圖6)，進一步說明S6對SMMC-7721細胞的生長具有抑制作用。

圖6 S6對SMMC-7721細胞集落形成試驗結果Fig.6 Clone formation assay of S6 in SMMC-7721 cells

2.6 S6對SMMC-7721細胞骨架結構的影響

鬼筆環肽染色結果如圖7所示，與溶劑對照組相比(圖7a)，隨著S6處理濃度的增加，細胞的熒光強度逐漸減弱(圖7 b、c、d)，且細胞體積皺縮變小，微絲在細胞內彌散分布，高濃度S6處理組(0.6 mg/mL)中出現排列紊亂的現象。

圖7 S6對SMMC-7721細胞骨架的影響Fig.7 Effects of S6 on the cytoskeleton in SMMC-7721 cells

3 討論與結論

天然產物黃酮類化合物的提取方法主要有索氏提取、有機溶劑萃取、超聲波提取法、微波萃取法等，提取溶劑常以有機溶劑為主[13-15]。本研究選擇不同極性有機溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及蒸餾水單獨或依次為溶劑，采用微波超聲波組合合成/萃取儀提取四川產土荊芥種子總黃酮，結果顯示，經正丁醇提取的S3和S6總黃酮提取率明顯較其他溶劑高(3.41%和3.97%)，以石油醚為溶劑提取率最低(0.28%)。表明總黃酮的提取率可能與溶劑極性有關，黃酮類化合物多以極性稍大的苷元形式存在，一般易溶于強極性溶劑中[16]，根據相似相溶的原理，溶劑極性越強，總黃酮的提取率可能越高，該結果與Shen等[17]研究極性越強的溶劑提取加拿大一枝花總黃酮得率越高的結果基本一致。而S4和S7中總黃酮提取率較低，可能是因許多黃酮類化合難溶或微溶于水[18]。槲皮素和山奈酚是多種植物黃酮的主要成分，且具有明顯的抗腫瘤作用[19-21]，本研究中對S1～S7中槲皮素、山奈酚的含量測定顯示，不同溶劑總黃酮提取物中槲皮素和山奈酚的含量不同，S2中槲皮素含量最高，為0.602 mg/g，S6中山奈酚含量最高，為0.479 mg/g，表明較高極性溶劑乙酸乙酯和正丁醇提取的槲皮素和山奈酚含量較高，這與Gu[22]和Wang[23]等測定不同植物有機溶劑提取物中槲皮素和山奈酚含量的研究結果一致。

提取溶劑除對提取物的成分影響較大，對其抗腫瘤活性也會產生相應的影響。Duan等[24]發現血人參石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位及乙醇提取物均有一定抑制腫瘤生長的作用。其中以乙酸乙酯部位的作用最佳。本研究中對S1～S7抗腫瘤作用評價顯示7種提取物的抗腫瘤作用也不盡相同。S6和S4對SMMC-7721細胞的IC50值分別為0.43和11.56 mg/mL，相差27倍，表明不同溶劑對提取物的抗腫瘤作用影響較大。同一種提取物對不同細胞的抑制效果也不盡相同，如S6對Hela和SMMC-7721細胞的抑制作用大于HepG2、Hep3b和L02細胞，但對HT29未檢測到抑制作用。

在土荊芥種子總黃酮的提取中，綜合不同溶劑提取物的總黃酮含量、溶解性和抗腫瘤作用，以S6(石油醚-乙酸乙酯-正丁醇)提取方案為最佳選擇。進一步以SMMC-7721細胞為靶標研究顯示，S6可導致該細胞粘附性和折光性下降，逐漸皺縮變圓至懸浮死亡，表明S6對SMMC-7721細胞具有明顯的細胞毒性，同時集落形成實驗顯示其具有抑制細胞集落形成的能力；鬼筆環肽染色后顯示，經S6處理后，細胞的熒光強度逐漸減弱，微絲在細胞內彌散分布，排列紊亂，表明S6可能影響細胞骨架重組，提示S6提取物對SMMC-7721細胞的毒性與細胞骨架有關。有關S6提取物的抗腫瘤作用機制有待進一步深入研究。