基于網絡藥理學方法研究丹參-葛根配伍治療冠心病的作用機制

馬 陽，王文軍，黃少杰，雷 露，王 凱，封小娜，丁 一*，文愛東*

1陜西中醫藥大學藥學院，咸陽 712046；2空軍軍醫大學第一附屬醫院，西安 710032

冠心病(coronary heart disease，CHD)又稱冠狀動脈性心臟病，是一種由冠狀動脈血流量減少導致的心肌缺血、缺氧甚至壞死進而導致的心臟疾病，亦稱缺血性心臟病[1]。CHD是心血管疾病的主要形式之一，心腦血管疾病發病率和死亡率高，對人類健康和生命造成了嚴重的威脅[2]。目前，治療CHD臨床上常用的方法是外科治療、西藥治療和中藥治療，較西藥而言中藥復方在治療CHD上具有一定的優點，它可以從多靶點、多通路等角度對疾病進行全面的治療，在臨床上也取得了較為顯著的療效[3]。

在眾多的現代研究中，丹參-葛根聯合應用于多種中藥復方中，即丹參葛根湯，具有抗氧化、舒張血管作用，可改善冠心病患者的脂質分布、血管功能和結構[4]。研究表明丹參葛根聯用治療冠心病心絞痛的療效比硝酸甘油更優，不良反應更少[5]。丹參-葛根合用針對病位在血脈或經脈的瘀血阻滯，葛根促進血管平滑肌的運動，來促進血液循環；丹參可以清除出血后或者血流緩慢引起的血管內外血液瘀滯，確保血流暢通。然而，其治療機制仍不明確。

網絡藥理學采用高通量組學數據分析、網絡數據庫檢索、計算機虛擬計算等方法，通過網絡分析，系統地觀察藥物與疾病的關系，解釋了多組分藥物協同作用的特點[6]。利用專業網絡分析軟件系統、整體地揭示藥物與機體的相互作用規律及機制，網絡藥理學注重整體性和系統性的特點，符合中醫藥理論[7]。本研究通過網絡藥理學方法研究丹參-葛根藥對治療CHD的作用機制，為該藥對的臨床應用和進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用軟件及在線工具

本次研究需要使用大量的軟件及在線工具，首先在中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)及Uniprot數據庫進行化合物靶標預測，在DrugBank、Therapeutic Target Database (TTD)和Disgenet數據庫分別進行冠心病發病機制靶標的預測，然后ChemDraw軟件中繪制化合物結構式，在STRING線數據庫中繪制蛋白互作網絡圖(PPI)，將數據導入生物學信息注釋數據庫(DAVID)進行京都基因與基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本體(Gene ontology，GO)富集分析，安裝Cytoscape軟件進行分析并繪圖，詳細內容見表1。

表1 本次研究使用的軟件及在線工具

1.2 冠心病靶點獲取

以Coronary Heart Disease為關鍵詞在TTD、DrugBank和Disgenet數據庫中查詢CHD的相關靶點。將檢索到的蛋白名稱復制到Uniprot數據庫中對靶點進行校正，整理并篩除重復項。

1.3 丹參和葛根成分和靶點獲取

研究以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug likeness，DL)為主的藥動學參數。OB通常用于確定口服給藥的藥物，其可能消除許多障礙以進入全身血液循環。DL用于準確預測“化合物”的含義，這可以很容易地幫助優化藥代動力學和藥物特性，如溶解度和化學穩定性[8]。以“丹參”和“葛根”為關鍵詞，通過檢索TCMSP數據庫獲取丹參-葛根的活性成分，篩選標準為OB≥30%且DL≥0.18[9]，將篩選所得的活性成分找到作用的蛋白名稱，將蛋白名稱復制到Uniprot數據庫中以提取相應的靶點，整理并篩除重復項。

1.4 共有靶點篩選

將上述所獲取的活性成分靶點和疾病靶點導入Venny2.1網站中得到化合物-疾病共有靶點個數，并繪制韋恩圖。

1.5 共有靶點PPI網絡構建

將共有靶點導入STRING數據庫，設置物種為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score(≥0.9)”并且隱藏網絡中斷開的節點，其他參數保持默認設置，獲取相互作用關系，將相互作用關系數據導入Cytoscape 3.6.1軟件繪制靶蛋白相互作用(PPI)網絡，然后再使用該軟件中的Network Analyzer對網絡進行分析，并根據連接度(Degree，PPI網絡中節點連接的邊的個數；Degree值越大，說明該節點與其他節點聯系更緊密，在網絡中越重要)調整節點的大小并繪制PPI網絡圖。

1.6 GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析

將1.4收集得到的共有靶點的官方縮寫上傳到DAVID數據庫，限定靶基因名稱列表為“Homo sapiens”，進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO富集分析包括分子功能(molecular function，MF)，細胞組分(cellular component，CC)和生物過程(biological proess，BP)三個部分。查閱相關資料分析對所得到的涉及靶點較多的通路進行分析，并繪圖。

1.7 構建活性成分-靶點-通路網絡圖

將1.6得到的分數較高的通路和1.4收集到的共有靶點以及藥物活性成分利用Cytoscape 3.6.0軟件繪制成“活性成分-靶點-通路”網絡圖。

2 結果

2.1 冠心病靶點獲取

通過檢索DrugBank、TTD和Disgenet數據庫獲取的靶點并導入Uniprot數據庫校正后分別篩選到84、6和913個靶點，刪除重復項后共納入981個靶點。

2.2 丹參合葛根化學成分及靶點獲取

通過TCMSP數據庫，根據設定的OB≥30%，DL≥0.18參數標準，共得到61個成分和納入176個靶點。丹參和葛根的化合物信息如表2所示。

表2 丹參和葛根主要活性成分表

續表2(Continued Tab.2)

標識TCMSP ID結構式Structure化合物名稱Compound口服生物利用度OB(%)類藥性DL(%)MOL002651Dehydrotanshinone II A43.760.4MOL002776Baicalin40.120.75MOL000569Digallate61.850.26MOL000006Luteolin36.160.25MOL0070365,6-Dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-2,3-dihydro-phenanthren-4-one33.770.29MOL0070412-Isopropyl-8-methyl-phenanthrene-3,4-dione40.860.23MOL0070453α-HydroxytanshinoneⅡA44.930.44MOL007048(E)-3-[2-(3,4-di-hydroxyphenyl)-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid48.240.31MOL0070494-Methylenemiltirone34.350.23MOL0070502-(4-Hydroxy-3-methoxy-phenyl)-5-(3-hydroxypro-pyl)-7-methoxy-3-benzo-furancarboxaldehyde62.780.4

續表2(Continued Tab.2)

標識TCMSP ID結構式Structure化合物名稱Compound口服生物利用度OB(%)類藥性DL(%)MOL007058Formyltanshinone73.440.42MOL0070593-Beta-Hydroxymethylle-netanshiquinone32.160.41MOL007061Methylenetanshinquinone37.070.36MOL007063Przewalskina37.110.65MOL007064Przewalskinb110.320.44MOL007068Przewaquinone B62.240.41MOL007069Przewaquinone C55.740.4MOL007070(6S,7R)-6,7-dihydroxy-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-dione41.310.45MOL007071Przewaquinone F40.310.46MOL007077Sclareol43.670.21MOL007079Tanshinaldehyde52.470.45

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

標識TCMSP ID結構式Structure化合物名稱Compound口服生物利用度OB(%)類藥性DL(%)MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid109.380.35MOL007141Salvianolic acid G45.560.61MOL007142Salvianolic acid J43.380.72MOL007143Salvilenone Ⅰ32.430.23MOL007145Salviolone31.720.24MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-quinone75.390.46MOL007151Tanshindiol B42.670.45MOL007152Przewaquinone E42.850.45MOL007154Tanshinone ⅡA49.890.4MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzo-furan-10,11-dione65.260.45

續表2(Continued Tab.2)

標識TCMSP ID結構式Structure化合物名稱Compound口服生物利用度OB(%)類藥性DL(%)MOL007156Tanshinone Ⅵ45.640.3葛根MOL000392Formononetin69.670.21MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL0029593′-Methoxydaidzein48.570.24MOL012297Puerarin[10]24.030.39

2.3 共有靶點篩選

將丹參和葛根的靶點和CHD的靶點通過Venny2.1構建韋恩圖篩選共有靶點，結果見圖1和表3。這些靶點既是藥物作用的靶點，也是疾病的靶點。故丹參-葛根很可能是通過這些靶點發揮治療作用。

圖1 CHD和活性成分靶點韋恩圖Fig.1 CHD and active ingredient target Venn diagram

表3 藥物與疾病共有靶點表格

2.4 共有靶點PPI網絡構建

將68個共有靶點導入STRING數據庫中，以獲取相互作用關系，再使用 Cytoscape 3.6.1繪制靶蛋白PPI網絡圖，見圖 2。此網絡共包括68個節點，160條邊，平均Degree值為4.71，PPI富集P值<1.0e-16。圖中Degree值越大則節點越大，結果提示丹參-葛根合用治療CHD的靶標中Degree值排名前10的靶蛋白為AKT1、TNF、APP、ENDI、VEGFA、TP53、IL6、AGTR1、F2、RXRA。

圖2 活性成分與疾病共有靶點PPI網絡圖Fig.2 PPI network map of active components and diseases

2.5 GO富集分析

在DAVID數據庫中進行GO富集分析(P<0.05)，將分析數據下載下來，把Count 值前五名做柱狀圖分析，結果見圖3所示。從生物過程的富集結果來講，丹參-葛根治療CHD的靶標主要參與RNA聚合酶II啟動子的轉錄、DNA模板轉錄和炎癥反應等過程的調節；從細胞組分的富集結果來說，丹參-葛根治療CHD的靶標主要集中于細胞外空間、質膜和核等部位；從分子功能富集結果來說，丹參-葛根治療CHD的作用主要體現在鋅離子結合、細胞因子活性和序列特異性DNA結合等方面。

表4 GO富集分析結果

續表4(Continued Tab.4)

類型TypeGO富集GO Enrichment-log10值-log10 valueTranscription factor activity,sequence-specific DNA binding2.644 805 558Cytokine activity5.302 815 183Heme binding4.490 704 727CCExtracellular space9.419 996 155Plasma membrane2.823 022 69Nucleus1.599 008 676Integral component of plasma membrane1.682 525 526Cytosol1.591 033 308BPPositive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter7.893 632 792Transcription,DNA-templated3.680 761 64Inflammatory response4.086 251 625Positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade4.583 008 521Positive regulation of transcription,DNA-templated3.099 745 564

圖3 GO富集分析結果柱狀圖Fig.3 GO enrichment analysis results histogram注：MF：分子功能；CC：細胞組成；BP：生物過程。Note:MF:Molecular function;CC:Cell composition;BP:Biological process.

2.6 KEGG通路富集分析

DAVID數據庫中KEGG分析結果如表5所示，把Count 值前20個通路做柱狀圖分析，結果如圖4所示。將KEGG分析結果導入Cytoscape軟件中通過“CluGo插件”進行KEGG通路富集(P<0.05)，結果如圖5。從圖中可以看出包括炎癥過程和免疫抑制(如TNF信號通路，T細胞受體信號通路)，心血管系統(如PI3K-Akt信號通路)和神經活性配體受體相互作用。丹參-葛根治療CHD的主要作用過程包括HIF-1、PI3K-Akt、TNF和T細胞受體等信號通路。

2.7 構建活性成分-靶點-通路網絡圖

利用Cytoscape 3.6.0軟件繪圖結果如圖6所示。由結果可知丹參-葛根配伍活性協同作用于成分多個靶點和多條通路，提示兩藥配伍可能有協同增效作用。如丹參中的丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、木犀草素(luteolin)與葛根中的葛根素(puerarin)涉及共有靶點的數目最多表示丹參-葛根配伍后主要是這三個活性成分來發揮藥效的；這些活性成分又同時通過TNF、VEGFA、TP53和IL6等靶點，協同作用于HIF-1、PI3K-Akt、Jak-STAT和TNF等信號通路，表明丹參-葛根配伍使用較單味藥的藥效強。

表5 KEGG通路富集分析

3 討論

本研究采用網絡藥理學方法研究丹參-葛根治療CHD的作用機制。結果顯示有68個與CHD相關的靶標，PPI網絡分析表明，丹參-葛根配伍后可能存在協同作用參與 AKT1、TNF、VEGFA、TP53、IL6等靶點，提示該藥對在治療CHD中具有多組分、多靶點的特點。TNF是一種細胞因子，通常與炎癥反應有關，其中TNF-α是一種非常重要的促炎因子，同時又能通過刺激相關血管生長因子的表達引起缺血后血管再生[11]；此外，VEGFA是促血管生成神經保護因子，可誘導神經發生[12]；IL6作為最重要的中樞基因，是一種T細胞和巨噬細胞衍生的細胞因子，參與多種生物活動，如嚴重的相位反應的產生、身體免疫系統的調節以及與運動期間的新陳代謝有關[13]；TP53是一種廣泛表達于胚胎和腫瘤組織中的轉錄因子[14]。近年來的研究表明，TP53在平滑肌細胞分化中也發揮調控作用，提示對新靶點分子的識別，可能為心血管疾病的治療帶來新的藥物啟示[15]。KEGG代謝通路富集分析結果表明，丹參-葛根治療CHD涉及HIF-1、PI3K-Akt、Jak-STAT和TNF等信號通路。TNF信號通路可促使促炎性細胞因子、趨化因子、生長因子和TNF-α本身等基因的表達放大炎癥反應和免疫效應[16]；HIF-1信號通路是缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路，HIF-1的活性對于組織缺血后的恢復是十分必要的。HIF-1可以上調與血管系統相關蛋白的基因表達，如促進血管生成的VEGF及其受體;使血管收縮的物質，如誘導型一氧化氮合酶等來增加血流，降低缺血損傷[17]；臨床研究表明，PI3K-Akt 通路在CHD的發生和發展中起著特殊的作用，通過調節心肌細胞凋亡、血管內皮再生、 物質代謝和炎癥反應，可影響CHD的發展[18]；Jak-STAT信號通路是細胞內重要的信號傳導通路，而Cagnin等[19]通過DNA微陣列和meta分析人類冠脈粥樣硬化斑塊修飾基因的表達，發現Jak-STAT通路在心血管保護中起著重要的作用。有研究表明丹參酮ⅡA和葛根素協同作用于PI3K-Akt通路，對心腦血管疾病產生保護作用[20,21]。有研究表明，丹參-葛根合用較單獨使用抗炎作用、舒張血管作用都明顯增加，合用的療效對心腦血管疾病都有很好的保護作用[22,23]。藥物成分-靶點-通路網絡分析結果顯示丹參中的丹參酮ⅡA、木犀草素和葛根中的葛根素涉及共有靶點數目最多，提示這些化學成分可能參與了丹參-葛根配伍治療CHD的過程。

圖4 KEGG通路富集分析結果Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis results

圖5 丹參-葛根治療CHD信號通路富集分析圖Fig.5 Analysis of enrichment of CHD signaling pathway in Danshen-Gegen

圖6 藥物成分-靶點-通路網絡圖Fig.6 Drug component-target-pathway network diagram注：橙色橢圓：活性成分；藍色六邊形：靶點；粉色長方形：通路。Note:Orange ellipse:active ingredient;blue hexagon:target;pink rectangle:pathway.

本研究結果表明，丹參-葛根中丹參酮ⅡA、木犀草素和葛根素等成分對TNF、VEGFA、TP53和IL6等相關靶點通過HIF-10、PI3K-Akt、TNF和Jak-STAT等信號通路參與炎癥反應、血壓調節、血管生成和收縮調節等過程。綜上，丹參-葛根治療冠心病的過程涉及多中有效成分、靶點和通路，符合中醫藥治療疾病多成分多靶點多通路的特點；同時，本研究也可作為丹參-葛根治療冠心病的分子機制，為深入研究丹參-葛根治療CHD的作用機制提供思路和參考。