ERLIN2蛋白高表達與結腸腺癌患者不良預后的相關性

李 冰，陳 靖，于素香，閆江鶴，朱鳳池

（1.保定市第四中心醫院 肛腸外科，河北 保定 072350；2.天津市腫瘤醫院 胰腺腫瘤科，天津 300060；3.保定市第四中心醫院病理科，河北 保定 072350；4.保定市第二醫院肛腸外科，河北 保定 071000）

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤， 對人類的健康和生命構成了嚴重威脅.早期結腸癌患者通常能夠通過手術治愈，而晚期患者通常需要手術、放療等多種方式聯合治療[1-2].原發性局部晚期腸癌經過根治性切除后，仍有11%的病人會出現復發和轉移[3-5].因此，尋找新型的預后因子對于提高臨床醫生的診斷及預測預后水平十分重要[6].

ERLIN2 屬于擁有共同的進化保守結構域SPFH（stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C）的家族蛋白成員之一.雖然包含的SPFH 蛋白位于不同的膜結構上，但是擁有共同特點，如這些蛋白的氮端序列為亞細胞定位和膜附著過程所必需，碳端序列上的卷曲螺旋結構域可介導高分子量復合體的裝配[7].Zhang 等[8]研究發現，ERLIN2 在人乳腺癌組織中異常高表達， 參與調節人乳腺癌相關的細胞周期進程.Cubillos-Ruiz 等[9]通過敲低和過表達ERLIN2 研究其在乳腺癌發生過程中的生物學行為，結果顯示，ERLIN2 通過促進腫瘤發生相關的細胞壓力下的保護作用，給予乳腺癌細胞選擇性生長優勢.Giulietti 等[10]認為，與內質網相關的ERLIN2可能會成為新型的區分胰腺導管腺癌高危和低危患者的生物標記物.

本研究通過免疫組化染色分析ERLIN2 在結腸腺癌樣本中的表達水平， 結合臨床數據分析ERLIN2 在結腸腺癌患者中的臨床意義.在體外水平利用shRNA穩定敲低ERLIN2 在結腸癌細胞系中的表達水平，通過MTT、克隆形成以及Western Blot 實驗檢測ERLIN2與結腸癌細胞系增殖的關系，以期為探究ERLIN2 與結腸腺癌發生和轉移的關系提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器與試劑

RM2235 通用型石蠟切片機，日本Leica 公司；光學顯微鏡，日本Olympus 公司.

ERLIN2（ab233440）、 Ki67（ab16667） 和 PCNA（ab92552），美國 Abcam 公司；β-Actin（BM0627），武漢博士德生物工程有限公司；通用型二抗PV6000，北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB（DA1010）、蘇木精（G1120）和 MTT（M1025），北京索萊寶科技有限公司.

結腸癌細胞系HCT116 和HT29，購自中國科學院細胞培養庫， 使用體積分數為10%的胎牛血清混合RPMI-1640 培養基在37 ℃下進行培養.

1.1.2 臨床資料

收集河北省保定市第四中心醫院和保定市第二醫院肛腸外科2012 年1 月至2018 年12 月接受結腸癌根治性切除術治療的患者82 例，所有患者均無術前放射治療和化療史，所有標本經H&E 染色后，經過病理科證實為結腸腺癌.患者臨床數據（年齡、性別、腫瘤T 分期、分化水平、臨床分期和淋巴結轉移）通過查閱病案科病歷資料獲得.以上過程均遵照本院倫理委員會發布的倫理學規范，患者本人及家屬均簽署了知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色及評分方法

利用免疫組化染色法評估ERLIN2 在結腸癌組織中的表達情況.將石蠟包埋標本切成5 μm 切片，室溫晾干，75 ℃下充分脫蠟1 h， 二甲苯浸泡20 min.脫蠟完全后，梯度濃度酒精（體積分數依次為100%、95%、85%、75%）進行水化.將切片浸泡在枸櫞酸鹽溶液中，高火煮沸進行抗原修復.滴加過氧化物酶阻斷劑充分阻斷過氧化物酶的作用， 繼續滴加抗ERLIN2 抗體（稀釋比例 1 ∶500），4 ℃下孵育過夜.次日， 滴加二抗常溫孵育1 h，滴加DAB 顯色，之后用蘇木素染色.脫水透明處理后， 中性樹膠封片.顯微鏡下觀察組織著色部位以及著色強度.

根據陽性細胞所占比例與染色強度評分之和對ERLIN2 的蛋白表達水平進行半定量評估.根據陽性細胞比例評分：＜5%為 0 分；5%～50%為 1 分；＞50%為2 分.染色強度評分：無著色或者輕微著色為0 分；中等著色為1 分； 強著色為2 分.兩者評分之和代表ERLIN2 表達水平：0～2 分為低表達組；3～4 分為高表達組.

1.2.2 shRNA 敲低 ERLIN2 表達

結腸癌細胞系HCT116 和HT29 分別被shRNA感染.以 Lipofectamine 2000（Invitrogen， 11668069， 美國）為轉染試劑，利用Western Blot 驗證轉染效率.具體操作：通過SDS-PAGE 電泳分離蛋白質樣品并轉移到PVDF 膜上，用脫脂牛奶與Tris 緩沖液加Tween-20在室溫下封閉膜1 h，然后與一抗和辣根過氧化物酶絡合的二抗一起溫育，使用成像儀觀察結果.一抗稀釋比例：ERLIN2（1 ∶2 000），Ki67（1 ∶800），PCNA（1 ∶800），β-Actin（1 ∶3 000）.

1.2.3 MTT 實驗

將處于對數生長期的細胞以2.0×104/孔的密度接種在96 孔培養板， 培養4 d 后評估細胞活力.向結腸癌細胞中加入10 μL 的MTT，孵育4 h，吸出液體培養物并加入200 μL 的二甲基亞砜，在570 nm 處記錄吸光度.每個實驗重復3 次.

1.2.4 克隆形成實驗

將細胞以6×102/孔的密度接種在六孔培養皿中，培養7 d 后， 用PBS 洗滌細胞， 室溫下用體積分數為4%的多聚甲醛固定10 min.再次用PBS 洗滌細胞后，用質量分數為0.1%的結晶紫染色， 對菌落進行計數，計算對照組和實驗組中的平均菌落數.所有實驗重復3 次.

1.3 統計分析

使用SPSS 22.0 軟件進行數據分析.利用卡方檢驗比較ERLIN2 高、 低表達組的患者對應的相關臨床數據的差異，利用Kaplan-Meier 方法比較2 組的總生存期（overall survival time）和疾病無病生存期（diseasefree survival time）， 雙尾 P ＜ 0.05 具有統計學意義.利用GraphPad Prism 6 軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 ERLIN2在結腸腺癌和癌旁組織中的表達水平

利用免疫組化染色評估結腸腺癌組織以及癌旁組織的ERLIN2 表達水平，結果如圖1 所示.

圖1 ERLIN2 在結腸腺癌和癌旁正常組織中的表達Fig.1 Expression of ERLIN2 in colon adenocarcinoma and normal paracancer tissues

由圖1 可以看出，ERLIN2 主要定位于細胞胞漿.通過評分分析可知， 結腸腺癌組織中共有40 例樣本為ERLIN2 高表達， 癌旁組織樣本中沒有ERLIN2 的高表達，均為陰性或者低表達.這些結果表明，與癌旁組織相比，ERLIN2 蛋白在結腸腺癌中的表達水平明顯升高.

2.2 ERLIN2的表達水平和患者臨床指標的關系

ERLIN2 的表達水平與結腸腺癌圍手術期臨床指標的相關性分析結果如表1 所示.由表1 可以看出，82 例接受結腸腺癌根治性切除術的患者中，ERLIN2高表達與較高的結腸腺癌T 分期以及較高的臨床分期相關，相關性具有統計學意義（P ＜ 0.05）.ERLIN2 的表達水平與患者年齡、性別、腫瘤分化水平以及淋巴結轉移無明顯相關性（P ＞0.05）.

表1 ERLIN2 的表達水平與結腸腺癌圍手術期臨床指標的相關性Tab.1 Correlation between ERLIN2 expression level and perioperative clinical indicators of colon adenocarcinoma

2.3 ERLIN2表達水平與患者疾病總生存率和無進展生存率的關系

疾病無進展生存率是接受結腸癌根治性切除術后的患者評價預后最重要的臨床指標之一.因此，本研究利用Kaplan-Meier 方法分析了ERLIN2 的高表達與不良預后的相關性， 結果如圖2 所示.由圖2 可以看出， 與ERLIN2 低表達組相比，ERLIN2 高表達組患者疾病的總生存期和無進展生存期更短，差異具有統計學意義（χ2=4.869，P=0.021；χ2=6.021，P=0.017）.

圖2 結腸腺癌患者高、低ERLIN2 表達組的生存分析Fig.2 Survival analysis of high and low ERLIN2 expression in the patients of colon adenocarcinoma

2.4 敲低ERLIN2表達對結腸癌細胞增殖能力的影響

利用shRNA 分別穩定敲低結腸癌細胞系HCT116和HT29 中 ERLIN2 的表達，Western Blot 檢驗結果證實， 本研究成功建立了2 株穩定敲低ERLIN2 的結腸癌細胞系.MTT 實驗結果如圖3（a）和圖3（b）所示，與對照組相比， 敲低ERLIN2 后2 株細胞系的增殖能力均顯著下降（P ＜ 0.05）.克隆形成實驗結果如圖3（c）和圖3（d）所示，敲低ERLIN2 后2 株細胞系的集落形成數目明顯減少（P ＜ 0.05）.Western Blot 檢測增殖相關蛋白 Ki67 和 PCNA 表達水平的變化，結果如圖3（e）～圖3（h）所示，與對照組相比，2 種蛋白在 2 株細胞系中的表達均顯著下降（P ＜ 0.05）.

圖3 結腸癌細胞系中敲低ERLIN2 表達對細胞增殖和相關蛋白表達的抑制Fig.3 Inhibition on cell proliferation and associated protein expression by the knockdown of ERLIN2 expression in colon cancer cell lines

3 討論與結論

結腸癌是全世界主要的公共衛生問題之一，有許多風險因素與結腸癌的發生相關， 如炎癥綜合征、遺傳因素、環境因素等[11].盡管目前可以通過一些腫瘤標記物如CEA、CA199 和CA125 等檢測到部分結腸癌患者[12]，但復發和轉移仍然會威脅到術后結腸癌患者的生命健康.為了更好地理解結腸癌轉移過程中的機制，開發針對結腸癌的分子靶向藥物和準確評估患者預后，對于與結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲相關的基因和蛋白的研究至關重要.

ERLIN2 是SPFH 家族蛋白成員之一，基因位于染色體8p11.2 上，該區域除經常在乳腺癌中發生改變以外，與常染色體隱性運動神經元疾病和中晚期尿路上皮腫瘤的發生也相關[13].本研究通過免疫組化染色方法評估82 例結腸腺癌樣本及癌旁組織中ERLIN2 蛋白的表達水平， 發現對比癌旁組織， 結腸腺癌標本中ERLIN2 的表達明顯升高.ERLIN2 高表達組患者的腫瘤T 分期和臨床分期更高，而疾病無進展生存期更短.這些結果均表明ERLIN2 在結腸腺癌發生發展過程中可能起到重要作用，可作為一個潛在的新型預測結腸腺癌患者預后的因子.

Cheng 等[14]研究發現，在乳腺癌細胞系中，過表達ERLIN2 能夠通過支持細胞生長和保護細胞免受內質網誘導的細胞凋亡來增強乳腺上皮細胞的適應能力.ERLIN2 在腫瘤形成過程中，針對多種細胞間壓力為乳腺癌細胞提供保護作用，并給予其選擇性生長優勢[13].乳腺癌細胞中ERLIN2 的過表達會對胰島素或者不飽和脂肪酸做出反饋，促進細胞內脂滴的累積，同時調節腫瘤細胞中脂肪生成的關鍵調節因子SPEBP 的活化，從而說明ERLIN2 以通過調控細胞溶質成分的方式來促進腫瘤細胞的生長.本研究在體外水平利用shRNA敲低結腸癌細胞系HCT116 和HT29 中ERLIN2 的表達，結果發現，敲低ERLIN2 后2 個結腸癌細胞系的增殖水平、 集落形成數以及細胞增殖相關蛋白Ki67 和PCNA 的表達水平均明顯下調.由此推測，ERLIN2 可能是通過調控細胞增殖來促進結腸癌的發展，有潛力成為治療結腸癌的分子靶點，具體調控機制有待進行深入探究.