大麻素受體1型基因多態(tài)性對(duì)利拉魯肽治療早期2型糖尿病患者臨床療效的影響研究

任麗君，王軍杰，馬豪莉，侯會(huì)娟，司馬盼盼，宋瑞捧

糖尿病傳統(tǒng)上被稱為“無癥狀疾病”，直到進(jìn)展到靶器官嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)才表現(xiàn)出癥狀［1］。作為成年人發(fā)病最普遍的糖尿病—2型糖尿病（T2DM），是一種由環(huán)境、遺傳因素、生活方式共同相互作用而產(chǎn)生的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病［2］。同時(shí)T2DM能夠?qū)χT多，如：心血管疾病、神經(jīng)性疾病、腦卒中、腎病、視力障礙、潰瘍性疾病、消化系統(tǒng)疾病和抑郁癥等代謝并發(fā)癥起到潛在的貢獻(xiàn)作用［3］。

利拉魯肽與人體內(nèi)源性酰化胰高血糖素樣肽1（GLP-1）氨基酸序列組成高度相似，既保持了天然GLP-1的功效，又增加了其代謝穩(wěn)定性［4］。在利拉魯肽的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，無論是單藥治療還是聯(lián)合其他藥物治療，利拉魯肽均能有效降低患者血糖水平，目前已經(jīng)成為臨床上常用的腸促胰島素激素藥物［5］。但臨床應(yīng)用過程中尚存在較大的個(gè)體差異，研究發(fā)現(xiàn)某些候選基因的多態(tài)性可能影響T2DM患者對(duì)疾病進(jìn)展的易感性或風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)于T2DM的基因多態(tài)性研究具有重要意義。

通過候選基因和全基因組關(guān)聯(lián)性分析研究至少發(fā)現(xiàn)了近100個(gè)遺傳變異對(duì)T2DM有貢獻(xiàn)作用的相關(guān)位點(diǎn)［6］。目前發(fā)現(xiàn)位于6Q14-Q15位置的內(nèi)源性大麻素受體1型基因（CNR1）在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用［7］，全基因包括了8個(gè)外顯子，在不同人群中具有較大的差異。其中CNR1基因密碼子435的沉默基因的多態(tài)性位點(diǎn)1260G＞A與肥胖、T2DM以及代謝綜合征等多種疾病有關(guān)［8］。因此CNR1基因1260G＞A的單核苷酸多態(tài)性被認(rèn)為是T2DM的重要關(guān)聯(lián)易感基因，由于不同個(gè)體基因組的差異既影響T2DM發(fā)生、發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，也影響個(gè)體對(duì)于相同治療藥物的不同反應(yīng)。目前在中國(guó)人群中尚未見關(guān)于CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)和利拉魯肽治療T2DM療效的關(guān)聯(lián)研究。因此本研究旨在探討真實(shí)世界中利拉魯肽治療早期T2DM患者的臨床療效及CNR1基因多態(tài)性分析，以期找到可以影響利拉魯肽降糖療效個(gè)體差異的基因多態(tài)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究設(shè)計(jì)為回顧性分析，選取2016年3月—2018年10月河南省直第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的早期T2DM患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診T2DM病程≤2年，且單用二甲雙胍不能達(dá)到有效的血糖控制，使用利拉魯肽進(jìn)行糖尿病治療；（2）體質(zhì)指數(shù)（BMI）為23.0～32.0 kg/m2；（3）空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，或餐后2 h血糖（2 hPG）≥11.1 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%［9］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往接受GLP-1類藥物治療；（2）使用利拉魯肽進(jìn)行治療的同時(shí)合并其他降糖藥物治療；（3）經(jīng)臨床診斷的其他類型糖尿病、肝腎疾病、心肌梗死或腦卒中等心腦血管疾病及惡性腫瘤。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)最終納入230例患者。選取同期本院健康受試者200例，未服用影響糖脂代謝的藥物，排除有糖尿病家族史者。本研究經(jīng)河南省直第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，患者或家屬均知曉本研究計(jì)劃并簽署知情同意書。

1.2 治療方式 患者均皮下注射利拉魯肽〔諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司分包裝，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20160037，規(guī)格：3 ml：18 mg〕進(jìn)行治療，初始劑量0.6 mg/d，隨后調(diào)整劑量為1.2 mg/d，治療期間可根據(jù)患者的血糖水平以及耐受情況進(jìn)行調(diào)整，但最大劑量＜1.8 mg/d。

1.3 療效評(píng)定 治療16周后評(píng)估患者治療前后的BMI、FPG、2 hPG和HbA1c水平。其中身高為患者入院時(shí)的身高，體質(zhì)量為患者治療前和治療16周后空腹?fàn)顟B(tài)下的體質(zhì)量。治療前及治療16周后抽取患者靜脈血2 ml，送至醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行測(cè)定，其中，F(xiàn)PG和2 hPG采用己糖激酶法測(cè)定，HbA1c采用低壓液相色譜法測(cè)定。

1.4 DNA提取及基因分型 抽取研究對(duì)象外周靜脈 血 5 ml， 采 用 Chelex-100（Bio-Rad，Hercules，CA）從全血中提取基因組DNA，于-20 ℃冰箱保存，用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。設(shè)計(jì)1260G＞A位點(diǎn)（rs1049353）的上下游PCR引物，對(duì)該位點(diǎn)及附近的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物序列5'-GAAAGCTGCATCAAGAGCCC-3'，下游引物序列5'-TTTTCCTGTGCTGCCAGGG-3'，擴(kuò)增條件：95 ℃初始變性6 min，隨后35個(gè)94 ℃循環(huán)30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸 7 min。37 ℃用 5 U MSP Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶（德國(guó)圣萊昂羅特酵素股份有限公司）將10 μl的PCR產(chǎn)物過度消化。通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物，A等位基因被切割成92、19 bp兩個(gè)片段，G等位基因保持未切割，產(chǎn)生111 bp的片段。

1.5 PCR擴(kuò)增及mRNA表達(dá)分析 收集患者新鮮外周血標(biāo)本，但由于新鮮的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells，PBMC）標(biāo)本較難獲取，最終納入125例新鮮外周血標(biāo)本采用淋巴細(xì)胞分離液Histopaque-1077對(duì)樣本進(jìn)行PBMC提取。用Trizol試劑提取PBMC中的RNA，real-time PCR儀器進(jìn)行mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)，引物序列如下：CNR1-1260G＞A上游引物5'-TTCACAGGGCCGCAGAAAG-3'，下游引物5'-GAGGCATCAGGCTCACAGAG-3'。探針序列如下：野生型探針5'-Fam-ATCAAGAGCACGGTCAAGATTGCC-TAMRA-3'，突變型探針5'-VIC-ATCAAGAGCACAGTCAAGATTGCCTAMRA-3'。mRNA采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，同組治療前后的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者基線臨床資料 230例患者中，男119例，女111例；年齡27～59歲，中位年齡43歲；BMI為（26.6±1.2）kg/m2；FPG 為（10.6±1.2）mmol/L；2 hPG為（14.2±1.2）mmol/L；HbA1c為（9.0±0.9）%。

1260G＞A位點(diǎn)的基因分型結(jié)果為：GG型188例（81.7%），GA型39例（17.0%），AA型3例（1.3%），最小等位基因頻率為0.098，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.550）。由于AA型例數(shù)較少，后期分析將GA型和AA型患者合并。該位點(diǎn)不同基因型患者性別、年齡、BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 利拉魯肽對(duì)早期T2DM的療效 治療16周后，230例患者BMI為（23.6±1.0）kg/m2，F(xiàn)PG為（5.8±0.8）mmol/L，2 hPG 為（9.9±1.3）mmol/L，HbA1c為（6.4±0.8）%。治療16周后患者BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t配對(duì)=29.127、50.475、36.860、32.746；P＜0.001）。

表1 1260G＞A位點(diǎn)不同基因型T2DM患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline clinical characteristics among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes

2.3 CNR1基因多態(tài)性位點(diǎn)易感性分析 對(duì)200例健康志愿者的CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)進(jìn)行基因分析，基因型分布頻率如下：GG型163例（81.5%），GA型35例（17.5%），AA型2例（1.0%），最小等位基因頻率為0.10，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.937）。T2DM患者和健康志愿者基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.104，P=0.949）。

2.4 CNR1基因多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)利拉魯肽療效的影響治療前，GG型和GA/AA型患者BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療16周后，GG型和GA/AA型患者2 hPG水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GA/AA型患者BMI、FPG、HbA1c水平均低于GG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GG型和GA/AA型患者治療16周后BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.5 CNR1基因多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)CNR1基因mRNA表達(dá)的影響 通過提取PBMC標(biāo)本中的RNA測(cè)定各組CNR1 mRNA的表達(dá)情況，并與1260G＞A位點(diǎn)的基因型進(jìn)行相關(guān)性分析。在125例病例樣本中，GG型102例，GA型22例，AA型1例，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.876）。AA型患者相對(duì)較少，將GA型和AA型合并，共計(jì)23例。GG型患者CNR1 mRNA表達(dá)水平為（4.2±1.3），高于GA/AA型患者的（2.8±1.2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.728，P＜0.001）。

2.6 不同基因型患者的不良反應(yīng)情況 使用利拉魯肽治療過程中，患者出現(xiàn)不同程度的惡心嘔吐、低血糖等不良反應(yīng)。不同基因型患者惡心嘔吐、低血糖及總體不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

3 討論

本研究納入了230例接受利拉魯肽治療的早期T2DM患者，通過對(duì)CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)基因分型并與患者的療效進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)攜帶A等位基因的GA/AA基因型患者相對(duì)于野生型GG型患者來說具有更好的控制血糖的相關(guān)療效，并通過125例PBMC標(biāo)本的CNR1 mRNA表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)不同基因型患者的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)較大的差異。CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)可能通過影響該基因mRNA的表達(dá)進(jìn)而影響利拉魯肽對(duì)T2DM患者的臨床效果。

表2 1260G＞A位點(diǎn)不同基因型T2DM患者治療前后BMI、FPG、2 hPG和HbA1c水平比較（±s）Table 2 Comparison of BMI，F(xiàn)PG，2 hPG，HbA1c among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes before and after treatment

表2 1260G＞A位點(diǎn)不同基因型T2DM患者治療前后BMI、FPG、2 hPG和HbA1c水平比較（±s）Table 2 Comparison of BMI，F(xiàn)PG，2 hPG，HbA1c among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes before and after treatment

注：與同組治療前比較，aP＜0.05

images/BZ_66_964_485_985_515.pngimages/BZ_66_1407_485_1428_515.pngimages/BZ_66_1844_485_1865_515.png基因型 例數(shù) BMI（kg/m2） FPG（mmol/L） 2 hPG（mmol/L） HbA1c（%）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后GG 型 188 26.7±1.2 23.6±1.0a 10.6±1.2 5.9±0.7a 14.2±1.2 9.9±1.4a 9.0±0.9 6.4±0.8a GA/AA 型 42 26.3±1.0 22.9±0.7a 10.4±1.1 5.3±0.6a 13.9±1.1 9.5±1.2a 8.8±1.0 6.1±0.7a t值 2.009 4.304 0.991 5.147 1.486 1.716 1.275 2.245 P值 0.068 ＜0.001 0.323 ＜0.001 0.139 0.088 0.204 0.026

表3 1260G＞A位點(diǎn)不同基因型T2DM患者不良反應(yīng)發(fā)生率比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of adverse reactions among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes

目前CNR1基因在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制和作用靶點(diǎn)仍然不完全清楚，但是越來越多的證據(jù)表明，CNR1系統(tǒng)失調(diào)與多種代謝性疾病有關(guān)，如肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和炎癥，這些因素也是T2DM的危險(xiǎn)因素［10-12］。據(jù)報(bào)道，CNR1基因中1260G＞A位點(diǎn)的多態(tài)性與多種病理學(xué)相關(guān)，如代謝綜合征等［12］、冠狀動(dòng)脈疾病［13］和克羅恩病［14］等。

本研究結(jié)果表明，利拉魯肽治療早期T2DM的治療效果良好，治療16周后各項(xiàng)指標(biāo)與治療前相比，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且不良反應(yīng)發(fā)生率較低。其中發(fā)現(xiàn)，治療16周后各組基因型患者的各項(xiàng)指標(biāo)與治療前相比均下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療16周后GA/AA型患者的BMI、FPG和HbA1c水平低于GG型患者，表現(xiàn)出優(yōu)于GG型的治療效果。對(duì)于GA和AA型患者，GG型患者的mRNA相對(duì)表達(dá)明顯較高。綜上推斷CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)多態(tài)性直接或間接與T2DM的治療效果相關(guān)。其作用途徑可能是由于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)可以通過中樞和外周兩種機(jī)制影響患者的攝食行為，過多的CNR1的表達(dá)，會(huì)直接增加患者的食欲，這從一方面也解釋了GG型患者由于mRNA較高的表達(dá)量，影響治療效果。同時(shí)攜帶A等位基因的患者在使用利拉魯肽治療后，會(huì)減輕對(duì)胰島素的抵抗，隨著代謝值的提高而減輕了更多的體質(zhì)量，從而影響利拉魯肽對(duì)T2DM治療的臨床效果，與相關(guān)研究結(jié)果基本一致［15］。此外，臨床中應(yīng)用利拉魯肽改善T2DM合并肥胖存在其他多種機(jī)制［16］，如：直接激活胰島β細(xì)胞上的相關(guān)肽，促進(jìn)胰島素的分泌與合成；延長(zhǎng)患者胃排空時(shí)間，控制患者食欲；抑制胰高血糖素的分泌，降低血糖水平等。已明確報(bào)道β細(xì)胞功能障礙和胰島素分泌受損是導(dǎo)致T2DM患者出現(xiàn)慢性高血糖的關(guān)鍵因素，而不是由胰島素抵抗所致。最新研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可作用于p-AMPKα/NOX2/JNK1/2信號(hào)通路對(duì)抑制β細(xì)胞凋亡，從而改善患者的血糖水平［17-18］。同時(shí)，利拉魯肽通過作用于線粒體ATP-鉀等離子通道，對(duì)T2DM患者在治療過程中減輕血管損傷，對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)起到保護(hù)作用，降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率［19］。

本研究通過對(duì)T2DM患者的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)可能直接或間接與T2DM的遺傳易感性相關(guān)，其GA/AA型可能通過影響該基因mRNA的表達(dá)影響利拉魯肽對(duì)T2DM患者治療的臨床效果。當(dāng)然，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生取決于不同風(fēng)險(xiǎn)等位基因、環(huán)境因素和生活方式之間的相互作用，幾個(gè)因素的相互作用可能導(dǎo)致低估或高估所研究多態(tài)性在確定表型中的作用［20］。本研究的數(shù)據(jù)只是本院的臨床數(shù)據(jù)，可能在群體的代表性上存在一定的局限性，不適用于不同遺傳或環(huán)境背景的人群，但為進(jìn)一步研究CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)T2DM治療效果的影響提供基礎(chǔ)，并在臨床預(yù)測(cè)中為藥物治療和藥理學(xué)臨床試驗(yàn)提供了可能的靶點(diǎn)。

利拉魯肽在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中被證實(shí)可以有效降低糖尿病患者血糖水平，然而在臨床應(yīng)用過程中利拉魯肽的降糖效果仍存在較大的個(gè)體差異。研究表明，基因多態(tài)性是造成眾多藥物出現(xiàn)個(gè)體差異的原因之一。本研究的結(jié)果表明CNR1基因1260G＞A位點(diǎn)的GA/AA型可能通過影響該基因mRNA的表達(dá)進(jìn)而影響利拉魯肽對(duì)T2DM患者的療效。

作者貢獻(xiàn)：任麗君、宋瑞捧進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；任麗君、王軍杰、馬豪莉進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；任麗君、侯會(huì)娟進(jìn)行數(shù)據(jù)收集及整理；任麗君、侯會(huì)娟、司馬盼盼進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；任麗君、侯會(huì)娟、司馬盼盼、宋瑞捧進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；任麗君撰寫論文；任麗君、司馬盼盼進(jìn)行論文的修訂；宋瑞捧負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。