基于近場熔體靜電紡絲PCR微流控芯片的構建與應用

王子忠　卓少木

摘 要

本文介紹了一種利用近場熔體靜電紡絲直寫技術制作PCR（聚合酶鏈反應，英文全稱為：Polymerase chain reaction）微流控芯片的工藝。本文先介紹了利用近場熔體靜電紡絲直寫技術在導電玻璃上面制作PCL纖維的過程，再介紹了PCR微流控芯片的內部結構設計，接著就介紹了PCL纖維的熱處理工藝以及芯片的制作方法，最后介紹了DNA提取與應用PCR微流控芯片驗證PCR實驗的效果。

關鍵詞

近場熔體靜電紡絲;PCR;微流控

中圖分類號： P313.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.05.007

0 前言

PCR（聚合酶鏈反應，英文全稱為：Polymerase chain reaction）[1， 2]是一種可以在生物體外進行的生物反應，能夠對DNA片段進行選擇性快速擴增[3，4]，在分子生物學的各個領域都有廣泛的應用[5]。制作PCR微流控芯片的關鍵是微結構的制作[6，7]，微結構的制作方式多種多樣，例如，利用減材制造的方式，如化學腐蝕、激光加工、光刻等;利用等材制造的方式，如壓印、注塑等;利用增材制造的方式，如3D打印、近場靜電紡絲等。這些制作工藝各有其特點，化學腐蝕具有難以控制加工量的多少，會產生污染液，加工時間比較長的特點;激光加工需要昂貴的激光設備，制造精度由激光設備的精度決定，加工時間比較短;光刻可以加工超高精度的PCR微流控芯片[8]，但設備昂貴，工藝復雜;壓印需要制造一個對應的模具，而模具的生產需要超精密加工用來實現，但模具難以更改;注塑可能因為模具的一些尺寸太小產生一些空隙、氣泡等;一般3D打印設備難以控制打印件表面質量和形狀精度;近場熔體靜電紡絲技術是一種在高壓電場下，沉積纖維可控的技術，基于近場靜熔體靜電紡絲制作微流控芯片的微結構精度可控，并且可以降低成本，同時還能快速根據用戶需求制作不同內部結構的微流控芯片。現階段近場靜電紡絲制作微流控芯片微結構主要是直線型或者十字交叉型微結構，這為制作PCR微流控芯片打下了基礎[9]。同時，我們發現纖維由于熱應力等因素的影響在冷卻過程中表面質量會變差，為了獲得表面質量更高的微通道，我們提出了一種近場熔體靜電紡絲纖維表面質量改進的方法——酒精氣氛下熱處理。

2006年，孫道恒等提出近場靜電紡絲技術[10]，當接收距離在穩定射流階段，維持PEO溶液射流所需電壓變小，纖維的沉積變得可控。他們探究了針頭液滴，聚合物溶液濃度，電壓，接收距離，速度對纖維形貌的影響。然而，纖維的形狀精度及表面質量都不太理想在后續的研究上，孫道恒等利用PEO溶液近場電紡沉積在硅片上PEO納米纖維作為犧牲層制作了納通道，其步驟如下：在硅片上沉積納米尺寸的PEO纖維，對帶纖維的硅片鍍膜，PEO纖維氯仿超聲氯仿處理溶解，清理獲得納米通道。

2016年，廣東工業大學的梁烽基于相似的技術制作了間距為50微米的納通道，間距可控的納通道可以作為光柵此的刻線。然而電紡纖維制作的納米通道表面質量亦不太理想。

2011年T.D Brown等提出了近場熔體靜電紡絲技術[11]，PCL在熔融狀態具備特別理想的粘度，探究了速度對射流狀態的影響，獲得有序纖維的條件：平臺運動速度大于或等于射流流動速度。2018年廣東工業大學的曾俊基于近場熔體靜電紡絲直寫技術探究了速度[12]，電壓，高度，氣壓，溫度對纖維直徑的影響，并且利用軟光刻方法制作了三種微通道，進行了液滴，層流實驗。

在本文中，基于近場熔體靜電紡絲特性，我們設計了PCR微流控的CAD圖形，進行了近場電紡。在觀測纖維形貌的過程中，我們發現纖維的表面質量不好，借用本課題組用酒精配置溶液來改善表面溶液近場靜電紡絲表面質量，提出了酒精氣氛下熱處理提高表面質量的方法。采用軟光刻的方法使用改善表面質量的近場電紡纖維作為PDMS微通道的模具，制作了PCR微流控芯片。最后，在制作的PCR微流控芯片上進行了相關實驗，并用電泳了PCR產物檢驗芯片有效性。

1 實驗材料

PDMS（polydimethylsiloxane，美國道康寧），導電玻璃（方阻7Ω，購于佛山晶美），PCL（poly（ε-caprolactone），Mv=80000即聚己內酯，購于深圳易生），金黃色葡萄球菌菌株及復蘇液（ATCC25923購廣東微生物有限公司），PCR緩沖液（購于大連寶日生物科技有限公司），定制薄膜加熱系統（廠家上海松導加熱傳感器有限公司），無水乙醇（AR級，購于阿拉丁），三氯全氟辛基硅烷（AR，購于Sigma-Aldrich）。

2 紡絲過程

近場熔體靜電紡絲直寫實驗設備的主要組成部分有：壓縮氣體供氣系統、直流高壓電系統、X-Y-Z軸運動平臺、加熱系統、照明系統。紡絲過程按如下步驟：將PCL顆粒裝填滿帶有可調節溫度加熱器的料筒，料筒針頭接負極，導電玻璃平穩地固定在近場熔體靜電紡絲直寫實驗設備的平臺上合適的位置上并接高壓電正極，將料筒上的加熱器溫度設置為150℃，壓縮空氣壓供氣系統的輸出氣壓設置為4kPa，直流高壓電系統的輸出電壓設置為1.5kV，X-Y-Z軸運動平臺的X與Y軸方向的運動速度設置為5mm/s，擠出熔體紡絲的噴頭末端到導電玻璃上表面的距離設置為0.9mm，然后根據預先設計好的PCL纖維分布軌跡進行紡絲。

3 微流控芯片設計

圖1所示是所設計的PCR微流控芯片，PCR微流控芯片主要包括三個區域：C區域覆蓋的PCL纖維的溫度為92℃（用于實現DNA的變性）;B區域覆蓋的PCL纖維的溫度為72℃（用于實現DNA的延伸）;A區域覆蓋的PCL纖維的溫度為42℃（用于實現DNA的退火），其他相關參數的具體見于表1。

4 熱處理及芯片制作

將真空電熱恒溫爐內部溫度加熱到50℃，保溫60min，確保干燥箱內達到50℃，同時把無水乙醇倒入容器內，接著把帶有PCL纖維的導電玻璃按照圖2中的（c）圖的放置方式放在真空電熱恒溫爐內部，設置電熱恒溫烘干箱加熱溫度為65℃、加熱時間為120min，使得PCL纖維在無水乙醇一直揮發的氣氛下熱處理 120min。將熱處理后的帶纖維玻璃放入真空斧內，滴一滴三氯全氟辛基硅烷進行表面硅烷化處理，將硅烷化表面處理后的PCL纖維倒入，在50℃真空環境下固化4h;取出固化后的PDMS打孔;3.異丙醇清理PDMS表面后 將PDMS，玻璃用氧等離子處理倒，處理后貼合，并熱壓輔助鍵合。（圖2中，圖（a）是近場近場熔體靜電紡絲直寫實驗設備核心部件的示意圖，圖（b）是帶有PCL纖維的導電玻璃，圖（c）是AR級無水乙醇對PCL纖維進行熱處理的示意圖（在此圖中，A是玻璃皿，B是AR級無水乙醇，C是帶有PCL纖維的導電玻璃，D是放置帶有PCL纖維的導電玻璃的玻璃支架，E是干燥箱;另外，實驗開始的時候，AR級無水乙醇的液面距離帶有PCL纖維的導電玻璃底面距離為1mm。），圖（d）是帶有PCL纖維的導電玻璃上面覆蓋有PDMS熔體冷卻后的狀態，圖（e）是冷卻成型后的帶有微流控芯片通道的PDMS倒模片，圖（f）是微流控芯片通道兩端有打孔的PDMS倒模片，圖（g）是PDMS倒模片與等面積的玻璃基板進行等離子體鍵合后的結合體，圖（h）是等離子體鍵合后的結合體在打孔的地方外接特氟龍管道接頭）。圖3所示的是近場熔體靜電紡絲直寫實驗設備核心部件的實物圖。圖4是已經鍵合成功的PCR微流控芯片實物圖。圖5是加熱器和PCR微流控芯片連接在一起的實物圖。

5 DNA的提取

由于金黃色葡萄球菌菌株是凍干粉，需要利用細菌復蘇液對菌株進行復蘇，將菌株凍干粉與蒸餾水以體積比1：100的比例進行稀釋，再把已經稀釋菌株的液體與復蘇液以1：10的體積比進行混合，取1ml菌株與復蘇液的混合液均勻地涂布在玻璃培養皿中的營養瓊脂培養基表面，并把培養皿放進電熱恒溫培養箱，把電熱恒溫培養箱調至37℃恒溫培養24小時。用潔凈玻璃鑷子刮取一兩個菌落放進裝有適量DNA提取液的離心管中，把離心管放置在高速離心機以12000r/min的轉速進行離心10min，舍棄上清，并置于-20℃保存。

6 結果與討論

6.1 纖維表面質量差的形成原因

在導電玻璃沒加熱的前提條件下，利用近場熔體靜電紡絲直寫技術制作的PCL纖維，令PCL纖維在室溫下自然冷卻成固態，放在光學顯微鏡以10倍放大倍數進行觀察，得到圖6中（a）的觀察結果;把帶有PCL纖維的導電玻璃放在加熱器上面，而加熱器放在光學顯微鏡的物鏡的平臺上，觀察PCL纖維表面的微觀結構，其實際操作的實物圖如下圖6中（d）所示;把加熱器快速加熱到150℃，光學顯微鏡同樣以10倍放大倍數進行觀察，得到下圖6中（b）的觀察結果;把加熱器的電源斷掉，移走加熱器，把帶有PCL纖維的導電玻璃放在光學顯微鏡的觀察平臺，令PCL纖維在室溫下自然冷卻成型，光學顯微鏡也同樣以10倍放大倍數進行觀察，得到下圖6中（c）的觀察結果。由實驗圖片可以知道，PCL纖維在室溫下自然冷卻成固態，纖維的微觀表面變得粗糙，表面質量很差;重新加熱到150℃之后，PCL纖維在受熱之后變成熔融狀態，纖維的微觀表面變得光滑，表面質量很好;受熱之后的PCL纖維再一次全部纖維同時在室溫下自然冷卻成型，此時的纖維的微觀表面變得粗糙，表面質量較差，但是比加熱器加熱前的粗糙度小一點，表面質量好一點。

6.2 形成熱應力的因素

由于PCL纖維在為完全冷卻成型之前屬于彈性體，彈性體在受熱或者冷卻過程中會，體積會膨脹或者收縮，從而纖維有可能會的內部形變與外部約束相互約束使得不能自由形變，此時就會產生應力，這就是熱應力。在熔融狀態的PCL纖維擠出的過程中，由于導電玻璃與空氣的比熱容不一樣，因此PCL纖維與空氣接觸的表面和與玻璃接觸的表面的散熱速度不一樣，從而會產生其中一部分熱應力。由于PCL纖維擠出是有先后順序的，從而PCL纖維的冷卻成型的順序也會和擠出的先后順序一樣，同一條纖維在同一時刻的不同節段的溫度存在一定的差異，因此也會產生一部分熱應力。

聚合物纖維內外冷卻速度不一致，聚合物大分子鏈在熔融過程中形成的不平衡構象，這種不平衡構象在冷卻固化時不能立即恢復到與環境條件相適應的平衡構象。

7 基于酒精的熱處理工藝

在一些微透鏡陣列的制作過程中，人們通常利用液體的流動性以及液體表面存在表面張力的特性，對未成微透鏡形狀的點狀樹脂、PMMA等熔點較高的高分子材料采用熱回流技術使得高分子材料的形狀變成微透鏡的形狀。但是熱回流是利用加熱微透鏡陣列所在的基板，利用基板的熱傳導使得熔點較高的高分子材料熔融[13]，如果采用熱回流工藝就會造成低熔點PCL材料表面的溫度不均勻，而且熱回流的加熱容易控制溫度，但是冷卻時的溫度難以控制;因此，如果利用熱回流進行熱處理PCL纖維會產生熱應力，難以改善PCL纖維的表面質量。如果對PCL纖維使用熱回流技術難以改善纖維表面質量，會使得纖維的高度降低影響PDMS的倒模成型。廈門大學的黃永芳在利用近場靜電紡絲技術制作微納通道的時候[14，15]，把PEO溶于水與乙醇的混合物中制作靜電紡絲材料，并得到質量良好的微納通道。由于酒精具有較強的揮發性能，因此含有PEO的靜電紡絲材料能夠快速成型、能夠盡可能地減少纖維產生應力而造成表面質量很差[16]。因此，本課題的熱處理方式就利用酒精的易揮發性，把PCL纖維放置于酒精氣氛中進行熱處理。

由于PCL纖維冷卻成型后，其表面質量比較差;從而難以滿足用來制作PCR微流控芯片的使用要求，所以要對PCL纖維表面質量進行改善，以達到使用要求。由于PCL纖維對溫度的變化比較敏感，因此本課題選用熱處理的方式去改善PCL纖維表面質量。對PCL纖維進行熱處理的具體方法是：把帶有PCL纖維的導電玻璃放在裝有AR級無水乙醇的容器的液面上空，導電玻璃下表面距離AR級無水乙醇的液面1mm，把裝有AR級無水乙醇的容器放進干燥箱設置不同的溫度與時間參數觀察最優的實驗效果。

對PCL纖維進行熱處理實驗有五組，分別為：在沒有酒精氣氛環境中把真空電熱恒溫爐加熱至50℃保溫60min（圖7的c、d）、在沒有酒精氣氛環境中把真空電熱恒溫爐加熱至60℃保溫60min（圖7的e、f）、在沒有酒精氣氛環境中把真空電熱恒溫爐加熱至65℃保溫60min（圖7的g、h）、在有酒精氣氛環境中把真空電熱恒溫爐加熱至50℃保溫60min（圖7的i、j）、在有酒精氣氛環境中把真空電熱恒溫爐加熱至65℃保溫60min（圖7的k、l）。另外，圖7中的a、b是未進行熱處理之前的微觀表面圖。從下面的實驗結果圖片可以看出，在無酒精氣氛的環境中加熱至50℃保溫60min后，PCL纖維的表面質量并沒有得到變好;在無酒精氣氛的環境中加熱至60℃保溫60min后，PCL纖維出現了團聚的現象;在無酒精氣氛的環境中加熱至65℃保溫60min后，PCL纖維的團聚現象更加嚴重;在有酒精氣氛的環境中加熱至50℃保溫60min后，PCL纖維的表面質量也沒有得到變好;在有酒精氣氛的環境中加熱至60℃保溫60min后，PCL纖維的表面質量明顯地變得很好了。在熱處理的實驗中，PCL纖維出現團聚現象的主要原因是PCL在受熱后變成熔融狀態表面張力和熱應力同時作用使得團聚發生;而PCL纖維的表面質量明顯地變得很好的主要原因是酒精氣氛使得熱應力被去除了，而表面張力不足以使其團聚。

8 PCR實驗

PCR擴增：使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase（Code No.R060A）進行PCR擴增，PCR反應體系的成分（其中Primer *1為CTG1095 F2，Primer *2為CTG1095 R2）比例是：CTG109 5- DNA：2×Gflex PCR Buffer（ Mg2+， dNTP plus）：Tks Gflex DNA Polymerase（1.25units/ul）：Primer*1（20uM）：Primer*2（20uM）：dH2O的體積比例為1：25：1：1：1：21。實驗操作方法：注射泵裝好需要進行PCR擴增反應的30μL液體，其輸出管直接接PCR微流控芯片的入口處的特氟龍管道接頭，PCR微流控芯片的出口處的特氟龍管道接頭外接管道把PCR擴增的液體引流到薄壁 Eppendorf管，PID調節溫度控制器不同的控制輸出分別接到不同的溫控區域;實驗第一步為利用PID調節溫度控制器控制不同區域進行加熱，接著控制注射泵把PCR反應體系注入PCR微流控芯片進行PCR擴增反應。

如表2為PCR擴增所用的設計的引物名稱以及堿基序列，需要進行PCR擴增的nuc基因的正向引物以及反向引物進行擴增的起始堿基位置。理論上提取的DNA片段長度為536bp。

把PCR產物各取5ul進行1%瓊脂糖凝膠電泳，其電泳的電場強度大小為2V/cm，以標記DNA（M：DL2，000 DNA Marker（購于寶生物工程（大連）有限公司））的電泳條帶為參照，分析管內的PCR擴增產物檢驗擴增的結果。其實驗結果圖如圖8所示，其中圖中的標號的含義分別代表M：DL2，000 DNA Marker、1：CTG1095 F2/R2 PCR產物（Primer *1為CTG1095 F2，Primer *2為CTG1095 R2）。

DL2，000 DNA Marker由六種不同長度的DNA片段組成，最短的四種DNA片段分別是100bp、250bp、500bp、750bp，即是如圖8所示的M列的標注的四種DNA片段。基于這個實驗所選的實驗環境以及實驗材料，這個PCR擴增實驗理論上提取的DNA片段長度為536bp，而從圖8的DNA電泳圖結果可以看出來CTG1095 F2/R2 PCR產物離DL2，000 DNA Marker的500bp的DNA片段電泳中心比較相近，因此可以得出來結論是：此次PCR擴增的效果基本達到預期的效果。

9 結論

本課題利用了近場熔體靜電紡絲直寫技術在導電玻璃上制作PCL纖維，然后再對PCL纖維進行熱處理，提高了PCL纖維的表面質量，接著就利用PDMS在PCL纖維上面倒模，最后把倒模出來的PDMS微流道鍵合在潔凈的導電玻璃上面做成PCR微流控芯片，最后驗證PCR微流控芯片的效果。最終的實驗結果表明，此課題中構建的PCR微流控芯片效果達到預期效果，從而具有良好的市場應用場景。

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