基于DNA條形碼的甘草屬植物的分子鑒別△

李珍珍，鄭司浩，尚興樸，鄧庭偉，王繼永*，趙潤懷*

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.中國中藥有限公司，北京 100195

甘草屬為豆科植物，全世界約有20種，中國分布有8種。《中華人民共和國藥典》規定甘草藥材的植物基原為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.[1]，其性味甘平，歸心、肺、脾、胃經，具有清熱解毒、補脾益氣、調和諸藥等功效，多用于脾胃虛弱、咳嗽痰多、倦怠乏力、脘腹和癰腫瘡毒、四肢攣急疼痛等[2-4]。藥用甘草在臨床應用廣泛、需求量大，在藥材市場及配伍使用中常出現同屬偽品相混用等情況，但甘草屬植物的化學成分以及藥用功效存在顯著差異，因此甘草屬植物的準確鑒定顯得尤為重要[5]。傳統的鑒定方法，如性狀鑒別、薄層鑒別、顯微鑒別、紅外鑒別以及理化鑒別等方法存在主觀經驗主義或穩定與重復性等方面的不足，很難科學準確地對甘草屬植物進行鑒別[6-9]。

DNA分子標記是以生物間核苷酸差異為基礎的標記技術，是在DNA水平上對遺傳物質差異的反應，能夠更精準地揭示種間、種內的差異，且不受環境、發育階段的影響，多態性強，數量豐富，分布廣泛均勻，DNA分子標記技術廣泛應用于物種鑒定及遺傳多樣性分析研究。DNA條形碼技術是一種較新的分子標記技術，具有操作簡便、準確性高等優勢，在中藥鑒定應用中發展迅速[10-11]。目前中藥DNA條形碼鑒定已有完善體系，成功補充了性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等傳統鑒定方法，能夠迅速簡便地鑒別物種，促進了現代中藥鑒定的發展[12-18]。近些年運用DNA條形碼技術進行甘草屬的鑒別已有研究報道，但其只基于2種條形碼技術對3種甘草屬進行鑒別，不夠全面[14]。本研究應用5種常用DNA條形碼序列，ITS、ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL，對甘草屬植物進行比較分析，通過比較各條形碼的鑒定能力，為甘草屬的鑒別提供依據與參考[19]。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在甘草藥材的主產區新疆、內蒙古和甘肅等地收集甘草、脹果甘草和光果甘草藥材樣本，并經中國中藥有限公司趙潤懷研究員鑒定為正品，鑒定標本存放于中國中藥有限公司，詳細樣品信息見表1。實驗試劑主要有天根植物基因組DNA提取試劑盒；2×TaqMix；ddH2O等。

球磨儀(FRITSCH PULVERISETTE 6，德國)，測序儀(ABI 3730XL，美國)。

1.2 方法

1.2.1樣本總DNA提取 取藥材樣品約30 mg，放入2.0EP管內，加入2粒小鋼珠，使用球磨儀以1800次/min轉速正反各研磨2 min。待樣品研磨好后，使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA。

1.2.2PCR擴增和電泳檢測 各序列PCR擴增條件及體系配置參考文獻[15]。擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3PCR產物測序及序列數據處理 PCR產物純化后，使用ABI3730XL測序儀對純化后的產物進行雙向測序。運用序列拼接軟件CodonCode Aligner對測序原始數據進行拼接，去除引物序列及低質量序列。從GenBank數據庫下載的甘草屬序列共16條(見表2)，將其與樣品測定的序列整合，運用MEGA 進行Clustal W比對，并建立鄰接樹(Neighbor Joining tree，NJ樹)，分析甘草屬植物間的親緣關系。基于生物信息學技術計算不同條形碼種內與種間變異及Barcoding gap，應用相似性搜索算法(BLAST1)和最近距離法(Nearest Distance)計算各序列的鑒定成功率[14]。

表1 甘草屬植物樣品信息

表2 甘草屬植物不同序列的GenBank登錄號

2 結果與分析

2.1 序列信息與鑒定成功率比較

實驗所得以及數據庫下載的各序列的長度、數量、DNA序列中核苷酸上鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(GC)含量、遺傳距離和鑒定成功率信息(見表3)。由于matK的鑒定成功率較低，因此，在接下來的分析中不加入討論。從表中顯示，4種序列長度介于223～828 bp。其中ITS2最短，為223 bp，rbcL最長，為607 bp。5種序列平均GC含量為ITS與ITS2較大(54.35%、53.12%)，其次是rbcL(42.2%)，psbA-trnH最低(25.08%)。ITS2平均遺傳距離最大(0.009 5)，其次是psbA-trnH序列(0.004 5)，rbcL序列最小(0.000 4)。本實驗采取2種方法分析鑒定成功率，BLAST1方法分析顯示，psbA-trnH序列的鑒定成功率最高為51.56%，ITS和ITS2序列相對較低，分別為43.75%和37.5%，rbcL序列的鑒定成功率最低為3.31%。K2P Nearest Distance方法顯示，4種序列的鑒定成功率大小順序與BLAST1方法顯示結果相同，即psbA-trnH 、ITS、ITS2、rbcL的鑒定成功率分別為51.61%、43.75%、36.51%、0.00%。

2.2 不同序列種內及種間差異分析

本研究從6個方面(種間變異、平均種間變異、種間最小變異、種內變異、平均種內變異和種內最大變異)對甘草屬進行了序列變異分析[21-22](見表4)。ITS2序列由于只有2條，故在后續的數據分析中并未列出；從表4中可以看出，平均種內變異(all intra-specific distance)rbcL序列最小(0.000 0)，psbA-trnH序列最大(0.001 2)；平均種間變異(all inter-specific distance)ITS2序列最大(0.013 3)，rbcL序列最小(0.000 5)；種內最大變異(coalescent depth) ITS2序列最小(0.000 0)；種間最小變異(minimum inter-specific distance)rbcL序列最小(0.000 8)。

理想的條形碼序列需具有明顯的種間變異、足夠小的種內變異，種間最小變異要遠大于種內最大變異[23]。本研究的5條序列中，ITS和ITS2序列種間最小變異均大于種內最大變異，且種內變異最小；rbcL的種內變異最小，但同時種間變異也最小；因此，在種內及種間差異比較上，ITS和ITS2的序列是較理想的序列。

表3 不同序列信息及鑒定效率

表4 不同序列種內及種間變異分析

2.3 不同序列barcoding gap檢驗

Barcoding gap代表理想的條形碼種內(Intra-species)與種間(Inter-species)遺傳變異之間的差異形成的間隔區[18]。圖1顯示，rbcL序列的種內和種間無重疊區，其次是ITS2和ITS序列重疊區域較小，而psbA-trnH序列種內種間重疊區域最多，重疊最少說明越易于將屬內不同種甘草分開。

2.4 NJ樹分析

基于K2P距離建立不同序列的NJ樹，可分析不同物種親緣關系的遠近，并可直觀地展現不同序列的物種鑒別情況。從圖2可以看出，只有psbA-trnH序列能把甘草各物種分開，其他序列均不能將光果甘草和脹果甘草分開，因此，psbA-trnH序列的鑒別效果最好。

3 討論與結論

《中華人民共和國藥典》(2015版)規定藥用甘草為甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖。在臨床藥理研究中，甘草含有的活性成分，包括三萜類化合物，如甘草酸、異甘草酸、黃酮類化合物，具有抗心律失常、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、調節免疫等藥理作用[24-33]。在藥材流通以及臨床使用中常混有一些非藥用甘草同屬偽品，如粗毛甘草G.asperaPall.、刺果甘草G.pallidifloraMaxim.等，而甘草屬植物的有效成分含量、藥理作用均有顯著差異[34-36]，因此甘草屬的混用情況對臨床用藥效果和安全造成了嚴重的影響。

DNA條形碼作為分子標記中的一種，具有能夠快速準確鑒別物種的能力。甘草屬植物傳統的鑒別方法多集中在生藥形態學和化學成分含量上的差異比較上[1]，而這些比較和鑒定存在很多不客觀、不穩定等因素，不能夠對市場中甘草屬進行準確的鑒別，因此，運用DNA條形碼技術鑒別甘草屬具有重要的現實意義。本研究通過分析4種DNA條形碼序列的種內(Intra-species)與種間(Inter-species)變異、遺傳距離barcoding gap、Nearest Distance和BLAST1計算的鑒定成功率以及利用Neighbor Joining tree(NJ樹)系發育樹的構建來分析不同序列對甘草屬的鑒別情況[19]。結果顯示，2種方法得出各個序列的鑒定成功率由高到低的順序為psbA-trnH、ITS、ITS2、rbcL。種內及種間變異方面，ITS和ITS2序列種間最小變異均大于種內最大變異，且種內變異最小；rbcL的種內變異最小，但同時種間變異也最小。在barcoding gap檢驗時，rbcL序列種內和種間無重疊區，其次ITS、ITS2的重疊區較小，重疊區面積越小說明序列越易于鑒別不同物種。NJ樹結果顯示，psbA-trnH、ITS2和ITS序列對甘草屬植物均有較好的分離效果，但只有psbA-trnH序列能把光果甘草和脹果甘草分開。綜合各指標分析結果表明，DNA條形碼技術可以準確地鑒別甘草屬植物，psbA-trnH 和ITS序列組合為鑒別多種甘草屬的較理想條形碼組合，這與楊瑞等[14]研究的不同基原甘草的分子鑒定結果一致[19]。本研究采用不同的數據分析方法更深入地研究甘草屬，結果顯示，psbA-trnH和ITS序列組合鑒別甘草屬，不僅可以鑒別甘草、脹果甘草或光果甘草，且可以鑒別其他非藥用甘草屬植物[19]。

注：A.ITS；B.ITS2；C.psbA-trnH；D.rbcL。圖2 不同序列的NJ樹分析