知母種子質量分級標準的研究△

陳彩霞，賈彩鳳，李先恩，趙晨光，侯俊玲，王文全，

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.河北大學 中醫學院，河北 保定 071000；3.北京康仁堂藥業有限公司，北京 101301；4.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；5.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 102488

知母為臨床常用中藥，是百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效[1]。知母主要有效成分為芒果苷、知母皂苷等，具有降糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、抑制腫瘤細胞生長等多種藥理活性[2-5]，也是知柏地黃丸、二母寧嗽丸、健步丸等200余種現代中藥的處方成分[6]。目前，知母野生資源急劇減少，栽培品逐漸成為藥材市場的主流商品。栽培知母主產于河北易縣、安徽亳州等地，山西、內蒙、山東、河南等地零散種植，但以河北產知母質量最佳[7]。

知母栽培生產中多以種子繁殖為主，種子質量優劣直接影響藥材的產量和品質，進而影響臨床療效。以往研究表明，不同產地來源、不同采收期和采種部位的種子質量差異顯著[8-11]。2009年河北省頒布了知母種子質量地方標準，但未見分級，且適用范圍不能涵蓋全國。國內市場流通的知母種子也存在質量標準不明確、檢驗不規范等問題，嚴重制約了中藥材知母產業的發展。有學者已對部分中藥材如遠志、桔梗、甘草、柴胡等種子的分級標準進行了研究[12-17]，關于知母種子質量分級標準研究還未見報道。本研究對來源于知母主產區及藥材市場的20份種子材料，進行種子質量檢測、確定質量分級指標，并以初步等級劃分的種子為材料進行田間對比試驗，驗證種子質量分級的合理性，旨在為中藥材知母的規范化生產和質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

知母種子來自河北安國、易縣、石家莊靈壽、張家口，山東濟南，安徽亳州，北京藥用植物研究所等地，均為人工栽培種子。經中國醫學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為知母AnemarrhenaasphodeloidesBunge.的種子。種子產地信息見表1。

表1 知母種子的來源

1.2 方法

1.2.1知母種子質量指標檢測 參照知母種子檢驗方法[18]，對收集到的20份不同產地知母種子的真實性、凈度、千粒質量、含水量、生活力、發芽率5項質量指標進行了測定，每批種子重復4次測定。

1.2.2知母種子質量等級初步劃分 20份知母種子的發芽率、凈度、千粒質量等質量指標數據，經過 Excel 和 SPSS 軟件進行整理、分析，通過主成分分析確定知母種子質量分級指標。采用K-均值聚類法分析，初步制定知母種子的質量分級標準。

1.2.3知母種子分級驗證 根據知母種子質量初步分級標準，分別將Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級種子進行田間對比種植，研究不同等級種子與知母種苗、藥材產量和品質的關系。試驗地點設在中國醫學科學院藥用植物研究所栽培試驗地，小區面積3 m2，重復3次。采用條播方式，行距25 cm，用種量約1500粒/小區(用種量依據知母育苗經驗)。小區間設置50 cm為保護行(隔離區)。于種植當年及第二年秋季，五點取樣法分別在每小區取樣15株，對不同等級知母種子種植后植株的根系生長狀況、單株產量等指標進行調查。2年生植株根莖采收后，去除須根，用微濕潤的毛刷仔細刷凈泥土后切片，55 ℃烘箱中快速烘干，粉碎后過50目篩，根據《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)進行藥材品質檢測[1]。

2 結果與分析

2.1 知母種子質量指標檢測

顯微鏡下觀察，知母種子長三棱形，背部呈弓狀隆起，腹棱平直，下端有一微凹的種臍。種皮黑色，有光澤。分別對20份知母種子的長度、寬度、凈度、千粒質量、含水量、生活力和發芽率等指標的測定，結果見表2。

表2 知母種子質量指標測定結果

由表2知，知母種子各質量指標檢測值變異范圍明顯不同。種子凈度、千粒質量、生活力及發芽率的變異范圍比較大，這可能與不同產地知母種子的生產技術水平、采收期、貯藏條件與貯藏年限有關。從表2數據看出，目前我國知母種子生產和市場流通的種子質量存在嚴重參差不齊的現象。就基地條件清楚的直采種子而言，栽培管理水平與種子質量密切相關，安國種苗基地種植技術成熟，集約化栽培，種子質量最好。靈壽、易縣基地均為山地仿野生栽培，所以種子質量較差，北京地區種子屬于粗放管理，也影響了種子質量。可見，通過提高栽培技術，加強田間管理能夠顯著提高知母種子的質量。

2.2 知母種子質量等級初步劃分

2.2.1檢測指標的相關性分析 種子質量好壞直接影響知母藥材的產量和質量的穩定。能反映知母種子質量的指標有多個，如種子大小、千粒質量、含水量、生活力、發芽率等，在評定種子質量時，測定的指標越多，所得到的質量信息越完整，但在實際生產中，很難對每批種子的多個質量指標都進行測定。由于各指標間具有一定的相關性，利用多個指標進行評價的信息往往是重疊的[19]。為明確影響知母種子質量的各項檢測指標之間的相關性，對知母種子的5項檢測指標數據進行相關性分析，結果見表3。

表3 20份知母種子5項質量指標的相關性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

相關性分析結果表明，種子含水量與凈度、千粒質量呈極顯著負相關，凈度與種子生活力呈極顯著正相關，與發芽率沒有顯著相關性。發芽率與千粒質量、種子生活力呈極顯著正相關。這說明知母種子質量各檢測指標之間存在重疊，可以通過主成分分析法，確定知母種子的分級指標。

2.2.2知母種子質量檢測指標的主成分分析 為確定影響知母種子質量的主導因子，利用SPSS 24軟件對知母種子各指標變量做主成分分析(見表4)。前2個特征值累計貢獻率已達到84.504%，說明前2個主成分基本包含了所有指標信息，取前2個特征值并計算出相應的特征向量。

表4 主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率

前2個特征向量分別為：

F1=0.809X1+0.888X2-0.686X3+ 0.888X4+0.718X5

(1)

F2=-0.423X1+0.141X2+0.617X3+ 0.220X4+0.617X5

(2)

式中：X1代表凈度；X2代表千粒質量；X3代表含水量；X4代表生活力；X5代表發芽率。

綜合來看，第一主成分中，凈度、千粒質量和生活力發揮重要作用，發芽率的作用也比較顯著，第二主成分中發芽率發揮作用最大，因此，可以考慮凈度、千粒質量、生活力、發芽率作為知母種子質量分級的主要參考指標。

制定種子質量分級標準，選擇既能反映種子質量，又便于測量，且生產上易于推廣應用的指標進行種子質量分級，才能使種子質量標準具有實踐意義?？紤]到種子生活力在實踐操作生產中的局限性，且種子生活力與種子發芽率呈極顯著相關，不考慮生活力作為知母種子質量分級指標。發芽率是知母發芽能力的重要指標，是種子內在質量的反映，為種子等級劃分的決定性指標。千粒質量與種子的成熟度和飽滿度密切相關，由于知母為無限花序，開花結實持續期較長，自7月上旬開始種子陸續成熟，一直延續到9月中下旬，使知母種子成熟度有顯著差異，進而影響知母種子的質量，且不同成熟度的種子與發芽率密切相關[11]，因此千粒質量是影響知母種子質量的關鍵指標。凈度是反映知母商品性狀的重要指標，在知母種子流通市場，常有多種雜質特別是果皮摻雜其中，且不同批次知母種子凈度差異顯著，給生產帶來嚴重影響，適當提高凈度標準有利于知母種子商品質量的整體提高。種子含水量與種子貯藏條件有關，受環境影響較大，因此凈度和含水量可作為知母種子質量標準的參考指標。

2.2.3種子質量初步分級 根據以上分析，本研究以知母種子的發芽率、千粒質量和凈度3項指標作為知母種子的質量分級指標。采用K-均值聚類法對20份知母種子的發芽率、凈度、千粒質量等質量指標數據進行聚類分析，結果見表5。

表5 知母種子質量單項影響因素K-均值聚類 最終聚類中心值

根據聚類數據結果，參考綜合因素和單項影響因素K-均值聚類分析結果及各分類，并結合生產實際，初步將不同產地知母種子的質量等級劃分為3類，結果見表6。

表6 知母種子質量等級初步劃分標準

分級方法采用最低定級原則，及任何一項指標不符合規定標準都不能作為相應等級的合格種子。本試驗所收集的20份樣本，有1份(5.0%)Ⅰ級種子，9份(45%)Ⅱ級種子，3份(15.0%)Ⅲ級種子。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級種子所占比例達到65%。7份不合格種子中，均與凈度偏低有關。但在種子生產過程中，可以通過加工提高種子的凈度。種子凈度偏低，貯藏過程中會因各種雜質導致種子感染霉菌機會增多，種子的發芽率降低，進而導致種子質量降低。因此，制定種子質量標準，有望能整體提高知母種子在商品流通中與實際生產中的質量。

2.3 知母種子質量等級標準田間驗證

根據知母種子質量等級初步劃分結果，分別選擇Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級種子進行田間對比種植試驗，研究不同等級種子與知母植株生長、種苗質量、藥材植株產量和品質的關系。

2.3.1不同等級知母種子種植1年植株生長狀況 種植當年秋季對不同等級種子分級種植的知母植株取樣調查，結果見表7。

表7 不同等級知母種子對植株生長及種苗產量的影響

注：表中同列不同小寫字母表示P<0.05(LSD檢驗)。下同。

由表7看出，3個等級知母種子相同種子粒數播種后，在正常田間管理條件下，每小區的植株保存率顯著不同，Ⅰ級、Ⅱ級種子因發芽率高，出苗快、出苗整齊，苗木長勢旺，因此最終植株保存率、株高、側根數均顯著大于Ⅲ級種子生產的種苗，但平均根長、種球直徑差異無統計學意義。Ⅲ級種子因發芽率低，試驗小區總體植株數少，根系生長空間相對較大，因此與Ⅰ級、Ⅱ級種子生產的種苗根系生長狀況如根長、種球直徑、單株根質量差異無統計學意義。根據知母種苗分級的研究成果[20-21]，以及生產實踐中對知母種苗的質量要求，不同種子分級播種1年，相同管理條件下各級種子培育的1年生種苗均能達到合格苗的要求，優質種子能顯著提高單位面積種苗產量。

2.3.2不同等級知母種子種植2年的植株生長狀況 不同等級種子種植第2年的秋季，調查樣株的根系生長狀況如根莖分蘗數、平均根長、側根數、單株根質量、小區產量等指標，結果如表8。

由表8知，不同等級知母種子播種2年后，植株根莖分蘗數、平均根長差異無統計學意義，Ⅰ級、Ⅱ級種子種植2年后植株的平均側根數和單株根鮮質量均顯著高于Ⅲ級種子，Ⅰ級種子的單株根莖鮮質量顯著高于Ⅱ級、Ⅲ級種子。小區保留株數和小區產量的表現則是Ⅰ級>Ⅱ級>Ⅲ級，且差異有統計學意義。不同等級種子在適宜的播種密度下，即單株生長不受空間限制的情況下，根系生長狀況差異無統計學意義，主要因保存株數不同導致同等面積藥材產量的差異有統計學意義，優質種子因保苗率高而使藥材產量也增加。

2.3.3不同等級知母種子種植2年對知母藥材質量的影響 為了解不同等級種子種植后對收獲藥材品質的影響，不同等級知母種子種植2年后收獲知母根莖，清洗干凈后，60 ℃烘干后粉碎，過60目篩(4號篩)，按照《中國藥典》方法進行藥材性狀和有效成分含量測定，結果見表9。

《中國藥典》規定知母藥材水分不超過12.0%，總灰分不超過9.0%，酸不溶性灰分不超過4.0%，芒果苷不得少于0.7%，知母皂苷BⅡ不得少于3.0%。由上表所列結果知，知母種子在北京地區分級種植2年后，各項指標如水分、總灰分、酸不溶性灰分以及知母皂苷BⅡ含量均能達到《中國藥典》標準，且在不同等級知母種子種植后的藥材間差異無統計學意義。但不同等級種子種植后，植株根莖中芒果苷的含量雖未達到《中國藥典》標準，但不同等級種子間差異有統計學意義，表現為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ。

表8 不同等級種子種植后2年植株根系生長和藥材產量狀況

表9 不同等級種子種植2年后對收獲藥材質量的影響 %

總之，田間對比種植結果表明，質量好的種子種植1年能夠提高知母育苗生產中單位面積合格種苗的產苗率。種植2年在適當播種密度，即單株生長空間不受限制的情況下，單株根系狀況差異無統計學意義，最終會通過植株保存率不同而顯著影響知母藥材的產量。

2.4 知母種子質量分級標準的確定

結合知母種子商品市場流通特性、實踐操作的可能性以及生產中對知母種子的質量要求，在知母種子質量等級初步劃分基礎上進行適當調整，確定了知母種子質量分級標準見表10。

表10 知母種子質量分級標準

Ⅲ級以外為不合格種子建議不作為生產使用。按照最低定級原則制定知母種子質量分級標準，即任何一項指標不符合規定標準都不能作為相應等級的合格種子。

3 結論與討論

知母種子是知母藥材規范化生產的首要條件和基礎，優質種子對穩定和提高知母藥材的產量和質量起著極為關鍵的作用。開展知母種子質量標準研究，對從源頭控制知母藥材及其產品的質量有著重要意義。本研究依據知母種子的自身特征，將不同來源地20份知母種子進行了真實性、凈度、千粒質量、含水量、生活力及發芽率等方面檢測研究，通過統計分析將知母種子初步分為3 個質量等級，并通過田間試驗驗證了分級標準的科學性和可行性。結合知母種子商品市場流通特性、實踐操作的可能性，最終確定知母種子的質量分級標準：Ⅰ級知母種子發芽率不低于85%，千粒質量不低于7.5，凈度不低于95%；Ⅱ級知母種子發芽率不低于70%，千粒質量不低于7.0，凈度不低于85%；Ⅲ級知母種子發芽率不低于65%，千粒質量不低于6.0，凈度不低于80%，各級種子含水量均小于10%。本標準的制定，綜合考慮了影響知母種子質量的各種因素，科學體現各因素的重要性。發芽率大小決定了種子的田間利用價值，可根據種子的發芽率計算田間實際播種量，發芽率是決定性指標。知母種子成熟期長導致種子飽滿度和成熟度差異顯著，種子飽滿度與種子發芽率、種苗生長勢及抗性密切相關。千粒質量反映了種子的飽滿度及成熟度，千粒質量為知母種子質量分級的重要指標。凈度反映了種子的清潔度，主要影響種子的商品性狀，且會影響貯藏中種子的壽命。收集的20份知母種子樣品中，凈度差異及其顯著，特別是市場收集的樣品，凈度明顯偏低，為進一步規范知母種子生產、經營以及提升種子交易過程中的整體質量，將凈度作為重要參考指標。種子含水量影響種子的安全貯藏和活力，所以含水量也為參考指標。本標準在兼顧我國當前知母種子標準化發展現實情況的同時，也考慮到未來的發展趨勢和需求，并通過田間試驗，驗證了標準的科學性和可行性，對于盡快實現知母種子標準化，保證知母栽培用種的質量，規范知母種子的市場流通，從源頭保證知母規范化種植和優質高產栽培具有現實可行的指導意義。