SIRT6對老年人皮膚成纖維細胞遷移能力和增殖能力的影響及機制研究

翟曉艷 裴亮 趙煥新 楊李旺 楊蓉 季新燕

1山西中醫藥大學解剖教研室，山西榆次 030619；2山西醫科大學第二醫院泌尿外科，太原 030001；3山西中醫藥大學生理教研室山西榆次 030619；4山西中醫藥大學藥理教研室山西榆次 030619

隨著年齡的增加，人體的器官、組織修復能力均減弱，老年人創傷愈合的速度也減慢［1］。成纖維細胞作為皮膚創傷修復的重要參與者，提高其增殖能力和遷移到創傷區的能力對于促進老年創傷愈合的意義重大［2?3］。沉默信息調節因子 2 同源類似物 6（silent mating type information regulation 2 homolog 6，SIRT6）作為公認的抗衰老因子，屬于3 類組蛋白去乙酰化酶。我們前期研究證實，SIRT6 可以提高老年人骨髓間充質干細胞的增殖和遷移能力［4］，但是對老年人成纖維細胞的作用及機制還不清楚。本課題初步探討SIRT6 對老年人皮膚成纖維細胞增殖和遷移能力的影響及機制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）細胞培養基、澳洲胎牛血清（美國Gibco 公司），0.25%胰酶（上海索萊寶生物科技有限公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學研究所），兔抗人SIRT6 多克隆抗體、鼠抗人β 肌動蛋白（ACTB）單克隆抗體和鼠抗人p65 及磷酸化p65（p?p65）多克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG 抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），高靈敏度化學發光檢測試劑盒（上海漢恒生物科技有限公司），Trizol試劑、反轉錄試劑盒（美國賽默飛世爾科技有限公司），SYBR Green 熒光定量試劑盒（北京天根生物科技有限公司），倒置相差顯微鏡（德國萊卡公司），DUB00型核酸蛋白分析儀（美國Beckman Coulter 公司），熒光定量PCR 儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

二、細胞培養

取山西醫科大學第二附屬醫院泌尿外科16 例健康男性包皮環切術切除的包皮皮膚組織，分離成纖維細胞［本研究已通過山西中醫藥大學醫學倫理委員會審查（批件號2019LL215），受試者均簽署知情同意書］。其中，青年組8例，年齡16 ～ 25（22.73±4.28）歲；老年組 8 例，年齡 50 ～ 70（57.36 ± 7.22）歲。剪去皮下組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，剪碎組織，加入PBS 離心，將細胞和組織碎片培養于含20%胎牛血清的IMDM 培養液中（含0.25%膠原蛋白酶Ⅱ），置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中消化、培養6 h。細胞貼壁后換為含20%胎牛血清的IMDM 培養液，待細胞80%融合后，0.25%胰酶消化，按1∶3 比例傳代。實驗中所用的細胞均為第4 代細胞。

三、SIRT6基因轉染

委托廣州賽業生物科技有限公司構建攜帶SIRT6 的慢病毒載體并合成病毒，將老年組皮膚成纖維細胞分成兩組，一組用SIRT6-慢病毒感染使其SIRT6 表達增高作為SIRT6 組，另一組以空病毒感染作為對照組。按照慢病毒感染實驗手冊流程在老年人皮膚成纖維細胞生長至40% ～50%融合時，以8 mg/L 海美溴銨為助染劑感染成纖維細胞，感染復數（multiplicity of infection）值為30，18 h 后換成無病毒正常培養基，培養72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察感染效率，提取總蛋白，Western 印跡法檢測SIRT6表達量，確定過表達SIRT6成功。

四、細胞劃痕實驗

將不同年齡組人皮膚成纖維細胞和感染后72 h的老年人皮膚成纖維細胞以2.5 × 105/ml 接種于6 孔板（每孔2 ml）中過夜貼壁，用20 μl移液槍槍頭在孔的中央垂直做“十”字劃痕，用PBS 沖洗3 次，洗去劃痕處掉落的細胞，換為無血清IMDM 培養基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養。分別在劃痕后即刻和24 h 拍照，用Image J 軟件測量劃痕處面積，計算遷移率。遷移率=（劃痕面積0h- 劃痕面積24h）/劃痕面積0h× 100%。

五、CCK8法檢測細胞增殖活性

將不同年齡組人皮膚成纖維細胞和感染后72 h的老年人皮膚成纖維細胞接種于96孔板中（7 000個細胞/孔），加入含20%胎牛血清的IMDM 培養基中培養過夜貼壁，分別在細胞貼壁后0、12、24、48 h加入CCK8 試劑，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育2 h后，用酶標儀測450 nm 波長處吸光度（A值）。每個時間點設3 個復孔，取均值代表細胞活性。根據細胞增殖活性繪制生長曲線。

六、Western 印跡法檢測人皮膚成纖維細胞p?p65表達

使用 RIPA（radio immunoprecipitatipon assay）蛋白裂解液提取不同年齡組人皮膚成纖維細胞和感染后72 h的老年人皮膚成纖維細胞總蛋白，用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取30 μl 蛋白經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，加5%脫脂牛奶封閉1.5 h 后，分別加入一抗兔抗人SIRT6 抗體（1∶1 000）、鼠抗人 p?p65 抗體（1∶500）、鼠抗人p?p65 抗體（1∶500）、鼠抗人 ACTB 抗體（1∶1 000），4 ℃過夜，TBST 洗 3次，加入1∶2 000 辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫避光孵育1 h，然后加入顯影液用圖像分析系統采圖，用Image J 軟件以ACTB為內參照分析相對灰度值，蛋白相對表達水平=目標蛋白灰度值/ACTB灰度值。

七、實時定量PCR檢測Col1、Col3、Itgβ1、Itgα 3、Itgα5 mRNA水平

用Trizol 試劑提取老年人SIRT6 組和對照組皮膚成纖維細胞總RNA，依據反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA。然后用SYBR Green 熒光定量法以ACTB為內參進行實時定量PCR反應。ACTB正向引物5′?GATGTCGCACGGTACCTG?3′，反向引物5′?TCTCTGGTTCTTTCAATCGGG?3′；Col1 正向引物 5′?GAGGGCAACAGCAGGTTCACTTA?3′，反向引物 5′?TCACCACCACCGATGTCCA?3′；Col3 正向引物 5′?CCACGGAAACACTGGTGGAC?3′，反向引物 5′?GCCAGCTGCACATCAAGGAC?3′；Itgβ1 正向引物5′?TTGTGAAGCCAGCAACGGACAG?3′，反向引物 5′?CAAGGCAGGTCTGACACATCTCAC?3′；Itgα3 正向引物 5′?ACCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTC?3′，反向引物5′?AGGCACAGGCTCTGGAGAACC?3′；Itgα5 正向引物5′?CGCCATCAGCACTGTGTCCAC?3′，反向引物 5′?AGCTGTGCAATGGACCAAGGC?3′。 反 應條 件 ：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環 ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以2-△△Ct表示目的基因mRNA相對表達量。

八、統計學方法

使用GraphPadPrism 5 軟件進行統計分析。實驗數據均為計量資料，以表示，兩組資料比較采用t?test檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、不同年齡組人皮膚成纖維細胞的形態

見圖1。倒置顯微鏡下，不同年齡組原代人成纖維細胞的形態沒有顯著差異，有散在細胞，也有圍繞在組織塊周圍呈放射狀排列的細胞，大部分為圓形或者梭形，細胞較小。第4 代時，細胞逐漸變大，梭形細胞逐漸扁平發出突起，其中老年組細胞突起更多。

二、皮膚成纖維細胞中SIRT6、p?p65表達

老年組人皮膚成纖維細胞中SIRT6 蛋白表達水平較青年組顯著下降（P＜ 0.05），但p?p65表達顯著升高（P＜ 0.05）。見圖2、表1。

三、皮膚成纖維細胞的遷移能力和增殖能力

圖1 不同年齡組人皮膚成纖維細胞傳代不同次數后細胞形態 黃色箭頭示散在細胞，紅色箭頭示放射狀排列的細胞。第4 代成纖維細胞較原代細胞增大，且逐漸扁平發出突起，老年組細胞突起更明顯

劃痕實驗顯示，青年組人皮膚成纖維細胞24 h細胞遷移率為（94.63% ± 12.32%），老年組為43.81% ± 18.84%，兩組差異有統計學意義（t=5.903，P=0.003）。見圖3。

CCK8 實驗顯示，12 h 時老年組與青年組人皮膚成纖維細胞活力均有增加，兩組間差異無統計學意義（t=0.991，P=0.512）；老年組24 h（t=4.043，P=0.007）和48 h（t=5.336，P=0.004）時的增殖活性明顯低于青年組，差異均有統計學意義。見圖4。

圖2 Western 印跡檢測不同年齡組人皮膚成纖維細胞中沉默信息調節因子2同源類似物6（SIRT6）和p?p65蛋白表達水平

表1 不同年齡組人皮膚成纖維細胞中沉默信息調節因子2同源類似物6（SIRT6）和p?p65蛋白表達水平比較（）

表1 不同年齡組人皮膚成纖維細胞中沉默信息調節因子2同源類似物6（SIRT6）和p?p65蛋白表達水平比較（）

例數8 8組別青年組老年組t值P值SIRT6 1.000±0.067 0.434±0.179 3.040 0.012 p?p65 1.000±0.093 1.694±1.148 2.949 0.015 p65 4.316±0.303 4.732±0.475 0.863 0.408

圖3 劃痕實驗檢測不同年齡組人皮膚成纖維細胞的遷移能力 24 h時青年組人成纖維細胞較老年組劃痕寬度明顯降低

圖4 不同年齡組人皮膚成纖維細胞生長曲線 青年組和老年組人皮膚成纖維細胞增殖活性在12 h時沒有差異，24 h和48 h時差異均有統計學意義。a：P ＜0.01

四、SIRT6 過表達對老年組皮膚成纖維細胞遷移能力和增殖能力及Col 1、Col 3、Itgα1、Itgα3和Itgβ1 mRNA表達水平的影響

細胞感染后72 h 可見老年人皮膚成纖維細胞綠色熒光蛋白陽性（圖5），且SIRT6 組細胞SIRT6蛋白表達水平顯著高于對照組，t=3.040，P＜0.01，見圖6、表2。

劃痕實驗顯示，SIRT6 組老年人成纖維細胞24 h 遷 移 率 為 68.30% ± 10.347% ，較 對 照 組39.48% ± 3.234%顯著改善，差異有統計學意義（t= 5.404，P＜ 0.05）（圖 7）。CCK8 實驗顯示，SIRT6 組老年人成纖維細胞24 h 和48 h 增殖速度較對照組提高明顯（均P＜0.05）（圖8）。實時PCR顯示，SIRT6 組成纖維細胞Col 3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA 表達水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表2。

五、SIRT6過表達對老年人成纖維細胞p?p65表達的影響

細胞感染后72 h Western 印跡檢測結果顯示，SIRT6 組老年人皮膚成纖維細胞p?p65 蛋白水平低于對照組（P＜ 0.05）。見圖6、表2。

討論

圖5 老年人皮膚成纖維細胞感染72 h 后倒置熒光顯微鏡觀察 對照組（感染空病毒）和SIRT6 組（感染SIRT6 慢病毒）老年人皮膚成纖維細胞中均可見綠色熒光蛋白表達

圖6 Western 印跡檢測老年人皮膚成纖維細胞感染SIRT6 慢病毒后p?p65蛋白水平的改變

圖7 劃痕實驗檢測細胞感染后老年人成纖維細胞遷移能力的改變 劃痕24 h后，感染SIRT6慢病毒組老年人皮膚成纖維細胞較感染空病毒組劃痕寬度顯著下降

圖8 感染慢病毒后老年人皮膚成纖維細胞增殖活性的變化細胞感染SIRT6 慢病毒后24 h 和48 h，增殖活性顯著高于對照組。a：P ＜ 0.05

創面愈合分為炎癥、再上皮化和組織重塑3 個主要階段，在創面愈合中關鍵因素是修復細胞的增殖和遷移能力。成纖維細胞作為皮膚創面愈合中組織重塑的核心細胞，起到至關重要的作用［1?2］。SIRT6 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenine dinucleotide）依賴的組蛋白去乙?；?，被證實可以抑制細胞衰老，并可以延長小鼠壽命［5?7］。本研究顯示，隨著年齡增長，人皮膚成纖維細胞形態學沒有發生顯著變化，但是SIRT6的表達降低，這與既往報道中SIRT6 在人成纖維細胞的表達隨年齡增加而降低的結果一致［7?8］。同時本研究還顯示，老年人皮膚成纖維細胞的增殖能力和遷移能力也有所降低。

為了探討SIRT6 的表達水平與成纖維細胞的增殖能力和遷移能力之間的關系，本實驗感染SIRT6 基因至老年人成纖維細胞，使其SIRT6 表達增高，觀察其對細胞增殖能力和遷移能力的影響。結果證實，SIRT6 表達增高后，老年人成纖維細胞的增殖能力和遷移能力均明顯改善，提示SIRT6 可能對創傷愈合中的組織重塑起促進作用，是改善皮膚創傷愈合的一個重要靶點。

表2 感染SIRT6慢病毒后老年人皮膚成纖維細胞中Col1、Col3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA以及SIRT6等蛋白表達變化（）

表2 感染SIRT6慢病毒后老年人皮膚成纖維細胞中Col1、Col3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA以及SIRT6等蛋白表達變化（）

注：n=4。SIRT6：沉默信息調節因子2 同源類似物6；Col1：Ⅰ型膠原蛋白；Col3：Ⅲ型膠原蛋白；Itgβ1、Itgα3、Itgα5：整合素亞基β1、α3、α5。對照組：感染空病毒；SIRT6組：感染SIRT6慢病毒

組別對照組SIRT6組t值P值Col 1 mRNA 1.0±0.133 1.3±0.092 0.976 0.352 Col 3 mRNA 1.0±0.362 2.2±0.214 5.692 0.015 Itgβ1 mRNA 1.0±0.140 1.7±0.119 4.478 0.043 Itgα3 mRNA 1.0±0.427 3.1±1.372 5.321 0.033 Itgα5 mRNA 1.0±0.261 1.9±0.063 5.773 0.015 SIRT6 1.000±0.178 2.730±0.067 3.040 0.002 p?p65 1.000±0.062 0.634±0.179 2.949 0.015 p65 4.621±0.285 4.884±0.582 0.863 0.408

創傷愈合是一個復雜的過程，多種因素參與其中，包括周圍其他細胞、細胞因子、膠原蛋白等，SIRT6 如何影響成纖維細胞增殖和遷移能力，目前還不清楚。我們進一步檢測成纖維細胞分泌的膠原蛋白、遷移能力相關的整合素等表達的變化。Col 1 主要存在于成熟組織中，Col 3 主要是新生的膠原蛋白，本研究中SIRT6 過表達后，Col 3 表達升高明顯，提示SIRT6 可能促進成纖維細胞增殖使新生Col 3 增多，也可能是SIRT6 本身可以提高成纖維細胞Col 3 的分泌能力，還有待進一步研究和證實。Rippa 等［9］報道創傷發生時，成纖維細胞會上調 Itgα5β1 和 α3β1 的表達，促進細胞向創傷區域遷移。本研究中 SIRT6 過表達后Itgβ1、Itgα3、Itgα 5 mRNA 水平增高，提示SIRT6 可能通過上調整合素表達促進細胞遷移。

NF?κB 參與細胞的多種生物學過程，其中包括衰老過程，目前研究普遍認為，NF?κB 是衰老相關的分泌表型，可以促進細胞的衰老。本研究中SIRT6 過表達后，NF?κB 亞基 p?p65 表達下降，遷移能力和增殖能力升高，提示SIRT6 可能通過抑制NF?κB 通路，提高老年人皮膚成纖維細胞的遷移和增殖能力，達到抗衰老的目的。有研究證實，SIRT6可以通過抑制 NF?κB 通路，延長小鼠壽命［6］。Goyarts 等［10］也發現，SIRT6 表達下調后 NF?κB 表達增多。本研究結果與上述結論一致。

綜上，SIRT6 可能通過抑制 NF?κB 通路從而促進成纖維細胞增殖和遷移，但是NF?κB通路如何影響細胞增殖和遷移，與下游的哪些基因和通路有關均有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突