硝呋齊特對A549細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其作用機制

李亞 李春梅

肺腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，臨床常采用化療等方法治療肺腺癌，但肺腺癌細胞耐藥性的產生導致患者預后差[1-3]。因而尋找新型治療方法對提高肺腺癌患者生存率及改善患者預后均具有重要意義。硝呋齊特(nifuroxazide)屬于硝基呋喃類抗生素，研究表明硝呋齊特具有抗炎、抗感染等作用[4]。相關報道指出硝呋齊特具有抗腫瘤作用，并可抑制肝癌等腫瘤細胞增殖及轉移[5]。但硝呋齊特在肺腺癌中的作用尚未可知。微小RNA(microRNA，miRNA)可調控基因轉錄后水平及翻譯水平從而調控細胞生長、發育等過程，研究表明微小RNA-219-5p(microRNA-219-5p，miR-219-5p)在肺腺癌等多種惡性腫瘤中表達下調并可參與腫瘤發生發展過程[6-7]。本研究主要探討硝呋齊特對肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，并探究其是否通過調控miR-219-5p表達而發揮作用，以期為臨床合理應用硝呋齊特提供理論依據。

資料與方法

一、材料與試劑

硝呋齊特購自湖北貓爾沃生物醫藥有限公司；肺腺癌A549細胞購自美國ATCC公司；DMEM培養基、胎牛血清與0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；miR-219-5p抑制劑(anti-miR-219-5p)及其陰性對照(anti-miR-con)購自廣州銳博生物科技有限公司；二 喹 啉 甲 酸 (bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒與蛋白裂解液均購自美國Pierce公司；Lipofectamine2000與Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；兔抗人B淋巴細胞瘤-2 ( Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白( Bax)單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；甲基噻唑基四唑( methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京索萊寶科技有限公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶( Propidium Iodide，PI) 細胞凋亡試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司。

二、方法

1 實驗處理與分組 肺腺癌A549細胞培養于DMEM培養基(含10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液)，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，收集對數生長期A549細胞，用不同濃度(2.5、5、10 μmol/L)的硝呋齊特處理細胞，分別命名為2.5 μmol/L nifuroxazide組、5 μmol/L nifuroxazide組、10 μmol/L nifuroxazide組，未經任何處理的細胞作為Control組[8]，各組細胞處理時間為48 h，MTT實驗篩選適宜作用濃度用于后續研究。A549細胞中分別轉染anti-miR-219-5p、anti-miR-con，隨后用濃度為10 μmol/L的硝呋齊特處理48 h，分別命名為nifuroxazide+anti-miR-219-5p組、nifuroxazide +anti-miR-con組。

2 MTT檢測細胞增殖 取對數生長期A549細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，加入DMEM培養液制備單細胞懸液，調整細胞密度為3×104個/mL，按照每孔3×103個細胞的密度接種于96孔板，按照“1.2.1”分組處理，每孔加入20 μL MTT溶液(濃度5 mg/mL)，37℃、5%CO2培養箱內繼續培養4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，低速振蕩10 min，應用SpectraMaxM5酶標儀檢測波長490 nm時各孔吸光度值(A值)。

3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期A549細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度，按照每孔1×106/mL的密度接種于6孔板，待細胞生長至80%左右，按照“1.2.1”分組進行處理，置于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養48 h，收集細胞，預冷PBS洗滌2次，依次加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

4 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 細胞遷移實驗：取各組對數生長期A549細胞，胰蛋白酶消化后加入不含血清的DMEM培養液制備單細胞懸液(5×104個/mL)，接種于Transwell小室的上室(200 μL/孔)，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養液(600 μL)，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱內培養24 h，棄上清液，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染液染色10 min，用棉簽擦掉未遷移細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察遷移細胞數。細胞侵襲實驗：用預冷培養液稀釋Matrigel基質膠(9:1)，Matrigel稀釋液平鋪于Transwell小室上室(40 μL/孔)，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育5 h，其余步驟同細胞遷移實驗。

5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-219-5p表達水平 采用Trizol法提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，miR-219-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAACGC-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，參照試劑盒配置反應體系：SYBR Green Master Mix 10μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，ddH2O補足體系至20 μL；反應條件：95℃ 2 min(循環1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環35次)。miR-219-5p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-219-5p相對表達量。

6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Bax、Bcl2蛋白表達 收集各組A549細胞，加入適量蛋白裂解液，裂解30 min(冰上)，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，每孔加樣30 μg(變性蛋白)，分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，室溫條件下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1 ∶1000)4℃孵育24 h，TBST洗滌，分別加入相應二抗(1 ∶2000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，加入ECL化學發光劑，曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

三、統計學處理

結 果

一、硝呋齊特對肺腺癌細胞A549活力的影響

與Control組相比，5μmol/L nifuroxazide組、10μmol/L nifuroxazide組肺腺癌A549細胞活力顯著降低(P<0.05)，由于硝呋齊特使用劑量10 μmol/L時細胞活力相對較低，因而選用10 μmol/L硝呋齊特進行后續研究(見表1)。

表1 硝呋齊特對A549細胞活力的影響

注：nifuroxazide：硝呋齊特；與control組比較，*P<0.05

二、硝呋齊特對A549細胞凋亡的影響

與Control組相比，nifuroxazide組A549細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)(見圖1、2、表2)。

圖1 硝呋齊特對A549細胞凋亡的影響

圖2 Western blot檢測硝呋齊特對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

三、硝呋齊特對A549細胞遷移、侵襲的影響

實驗結果顯示，相對于Control組，nifuroxazide組A549細胞遷移與侵襲數均顯著減少(P<0.05)(見圖3、表3)。

表2 硝呋齊特對A549細胞凋亡的影響

注：與control組比較，*P<0.05

表3 硝呋齊特對A549細胞遷移、侵襲的影響

注：與Control組比較，*P<0.05

圖3 硝呋齊特對A549細胞遷移、侵襲的影響

四、硝呋齊特對A549細胞中miR-219-5p表達的影響及anti-miR-219-5p的轉染效果

與Control組比較，nifuroxazide組A549細胞中miR-219-5p表達水平顯著升高；相較于nifuroxazide +anti-miR-con組，nifuroxazide+anti-miR-219-5p組A549細胞中miR-219-5p表達水平顯著降低(見表4)。

五、抑制miR-219-5p的表達逆轉硝呋齊特對A549細胞的抑制作用

與nifuroxazide +anti-miR-con組相比，nifuroxazide+anti-miR-219-5p組A549細胞活力顯著增強(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，遷移與侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)，Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。(見圖4、表5)。

表4 硝呋齊特對A549細胞中miR-219-5p表達的影響及anti-miR-219-5p的轉染效果

注：與control組比較，*P<0.05；與nifuroxazide +anti-miR-con組比較，#P<0.05

圖4 Western blot檢測A549細胞中凋亡相關蛋白的表達量

討 論

肺腺癌的主要病理類型是非小細胞肺腺癌，目前臨床現有醫療水平可提高肺腺癌患者生存率，但治療效果具有一定局限性，晚期肺腺癌患者5年生存率較低[9-10]。肺腺癌細胞呈侵襲性生長，增加患者死亡率，細胞惡性增殖可促進腫瘤惡性進展[11]。因而尋找高效低毒性抗肺腺癌藥物具有重要意義。

表5 抑制miR-219-5p的表達逆轉硝呋齊特對A549細胞的抑制作用

注：與nifuroxazide +anti-miR-con組比較，#P<0.05

硝呋齊特可誘導乳腺癌細胞凋亡[12]。硝呋齊特還可誘導骨肉瘤細胞凋亡，還能夠抑制骨肉瘤細胞遷移及侵襲[13]。研究表明硝呋齊特可通過調控Stat3信號通路從而抑制結直腸癌細胞轉移[14]。本研究結果顯示硝呋齊特處理肺腺癌細胞后，細胞增殖活力顯著降低，遷移與侵襲能力明顯受到抑制，細胞凋亡率顯著升高，說明硝呋齊特可降低肺腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，并誘導細胞凋亡。研究表明Bax可通過激活線粒體途徑激活細胞凋亡執行因子Caspase-3從而促進細胞凋亡，Bcl2可抑制細胞凋亡[15]。本研究結果顯示硝呋齊特可顯著促進肺腺癌細胞中Bax的表達而抑制Bcl2的表達，提示硝呋齊特可通過調控Bax、Bcl2表達從而誘導細胞凋亡。

miR-219-5p在胰腺癌細胞中表達下調，上調miR-219-5p表達可抑制細胞增殖及侵襲并促進細胞凋亡[16]。研究表明miR-219-5p可通過抑制HMGA2表達從而抑制卵巢癌細胞增殖及轉移[17]。相關研究報道指出miR-219-5p可通過抑制BCL-2表達從而抑制惡性黑素瘤細胞增殖及轉移[18]。本研究結果顯示硝呋齊特可明顯促進肺腺癌細胞中miR-219-5p的表達，抑制miR-219-5p表達可部分逆轉硝呋齊特對肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用。提示硝呋齊特可通過上調miR-219-5p的表達而抑制肺腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡。

綜上所述，硝呋齊特可通過上調miR-219-5p的表達而降低肺腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導細胞凋亡，硝呋齊特可能成為治療肺腺癌的一種有研究前景的藥物。但關于硝呋齊特對相關信號通路的調控作用及其對miR-219-5p下游靶基因表達的影響均需深入研究。