miR-138-5p通過靶向SETD6基因調控Raf/MEK/ERK通路抑制肝癌細胞遷移、侵襲的分子機制

薛華 姚豫桐 駱樂 向光明 黃孝倫

(四川省醫學科學院 四川省人民醫院肝膽胰外科，四川 成都 610027)

肝癌是常見的惡性腫瘤，死亡率居于所有惡性腫瘤的第三位〔1〕。肝癌一般發現較晚，且進展速度快，患者死亡率高。目前肝癌的治療主要是肝切除、肝移植、化療等綜合療法，雖然治療技術取得了一定的進展但是肝癌患者的預后仍然較差，因此尋找新的靶向治療藥物對于肝癌的治療具有重要意義。微小RNA(miRNA) 是長度為20～24個核苷酸的小RNA，可通過與靶基因3'非翻譯區(UTR)結合，調控靶基因的表達，進而參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程〔2,3〕。miR-138-5p在結直腸癌(CRC)組織中下調，其表達水平與臨床分期、淋巴結轉移和總生存率低有關，miR-138-5p通過靶向程序性死亡配體(PD-L)1顯著抑制體內CRC細胞生長，抑制體內的腫瘤生成〔4〕。miR-138-5p在宮頸癌中的表達降低，促進腫瘤的增殖〔5〕。賴氨酸甲基轉移酶(SETD6)在膀胱癌組織中高表達，過表達促進膀胱癌細胞增殖、菌落形成和遷移〔6〕。SETD6過表達促進胃癌細胞增殖、菌落形成和遷移〔7〕。但miR-138-5p在肝癌細胞中的表達及其對肝癌細胞遷移、侵襲的影響，且miR-138-5p是否通過靶向SETD6調控Raf/MEK/細胞外信號調節激酶(ERK)通路影響肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移還尚未可知。本研究分析miR-138-5p是否靶向SETD6基因調控Raf/MEK/ERK通路影響肝癌細胞的侵襲和遷移。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 人正常肝細胞L02、肝癌細胞HepG2、Hep3b、HuH-7細胞購于上海中科院細胞庫，DMEM培養基、胎牛血清購于GIBCO公司，轉染試劑lipofectamine TM2000購于美國Invitrogen公司，Transwell小室、基質膠購于Millipore公司，miR-con、miR-138-5p mimics序列由上海吉瑪公司合成，SETD6過表達及空載體質粒購于北京以義翹神州生物科技有限公司，SETD6、CyclinD1、MMP-2、β-actin一抗購于美國CST公司，IgG二抗購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞的培養 胰蛋白酶消化L02、HepG2、Hep3b、HuH-7細胞，按照一定比例培養于25 cm2培養瓶中，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，5%CO2、37℃條件培養箱中傳代培養，隔天換液，待細胞生長狀態良好時進行后續實驗。

1.2.2載體構建及細胞轉染 體外合成miR-138-5p的反義互補序列構建anti-miR-138-5p質粒及其陰性質粒anti-NC，合成miR-138-5p的前體序列構建miR-138-5p mimic質粒，同時構建pcDNA、pcDNA-SETD6質粒。lipofectamine TM2000將anti-miR-138-5p、anti-NC、si-NC、si-SETD6質粒分別轉染入Hep3b細胞，轉染4～6 h后更換完全培養基。獲得穩定高表達miR-138-5p的Hep3b細胞株，在穩定高表達miR-138-5p的細胞株基礎上轉染si-NC、si-SETD6獲得穩定細胞株anti-miR-138-5p+si-SETD6和anti-miR-138-5p+si-NC，培養48 h后進行后續實驗。將Hep3b細胞分為NC組(正常培養的細胞)、miR-con組(轉染miR-con)、miR-138-5p組(轉染miR-138-5p mimic)、si-con組(轉染si-con)、si-SETD6組(轉染si-SETD6)、anti-miR-con組(轉染anti-miR-con)、anti-miR-138-5p組(轉染anti-miR-138-5p)、miR-138-5p+pcDNA組(miR-138-5p和pcDNA共轉染)、miR-138-5p+pcDNA-SETD6組(miR-138-5p和pcDNA-SETD6共轉染)。

1.2.3qRT-PCR 處理后細胞提取總RNA，分別以U6、β-actin為miR-138-5p、SETD6的內參基因。qRT-PCR體系 為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl，H2O 8 μl，反應程序為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環。引物序列：miR-138-5p:正義鏈5'-AATTCAGTTGAGGAACAGGTA-3'，反義鏈5'-CTGGGCCCAGTGTTCAGACTACC-3'；U6:正義鏈 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反義鏈5'-TCACGAATTTGCGT-3'；SETD6:反義鏈5'-GGCAGTCAGCCCCTTTGTG-3'，反義鏈5'-TGCAGGGTTGTGATGAAAGGA-3'；GAPDH:正義鏈5'-ATGACTCTACCCACGGCAAG-3'，反義鏈5'-GG AAGATGGTGATGGGTTTC-3'。

1.2.4Western印跡法檢測蛋白表達情況 處理后細胞提取總蛋白，測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min；蛋白按照30 μg上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶封閉1.5 h；一抗(SETD6、CyclinD1、MMP-2、β-actin)4℃孵育過夜，二抗孵育1 h；增強化學發光(ECL)顯影液發光，凝膠電泳成像系統采集圖片，以β-actin為內參計算蛋白表達水平。

1.2.5噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況 待檢測組別細胞，加入MTT 20 μl 混勻，培養4 h；加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl混勻，培養15 min；酶標儀檢測吸光值(OD值)，計算細胞存活率。

1.2.6Transwell實驗檢測肝癌細胞的侵襲和遷移能力 Transwells上室以每孔104個細胞添加，下室加入DMEM培養基，培養12 h后棄去上室中培養基，棉簽擦除未穿過細胞，固定，結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗；隨機選取5個低倍鏡觀察，計算遷移細胞數。

實驗前將Matrigel 膠放置于冰上解凍，按照1∶2與無血清DMEM培養基混勻，制備Matrigel基質膠；將Matrigel基質膠包被Transwells上室，每孔104個加入Transwells上室，剩余操作同遷移實驗，計算侵襲細胞數目。

1.2.7雙熒光素酶實驗檢測miR-138-5p 對SETD6的影響 TargetScan生物信息學預測miR-138-5p 與SETD6的互補序列，擴增結合位點的片段，將擴增片段插入到熒光素酶載體中，構建野生型(WT)-SETD6-3'UTR質粒；點突變技術進行位點突變，構建突變型(MUT)SETD6-3'UTR質粒，將WT-SETD6-3'UTR、MUT-SETD6-3'UTR、與miR-NC、miR-138-5p 分別共轉染至Hep3b細胞，轉染48 h后檢測熒光強度。

1.3數據分析 采用SPSS22.0軟件進行數據分析，GraphPad Prism 進行圖片的制作。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-138-5p和SETD6在肝癌細胞株中的表達 與人正常肝細胞L02比較，肝癌細胞HepG2、Hep3b、HuH-7中miR-138-5p的表達水平顯著降低，SETD6 mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。選擇Hep3b細胞進行后續實驗。

表1 肝癌細胞株中miR-138-5p和SETD6的表達

與L02組比較：1)P<0.05

圖1 肝癌細胞株中SETD6蛋白表達結果

2.2轉染miR-138-5p抑制肝癌細胞遷移、侵襲 與NC、miR-con組比較，miR-138-5p組miR-138-5p的表達水平顯著升高，細胞存活率、侵襲和遷移細胞數目顯著減少，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測轉染miR-138-5p對肝癌Hep3b細胞中CyclinD1、MMP-2的表達量

表2 轉染miR-138-5p對肝癌Hep3b細胞中miR-138-5p、CyclinD1、MMP-2的表達量和遷移、侵襲的影響

與NC、miR-con組比較：1)P<0.05

2.3沉默SETD6抑制肝癌細胞遷移、侵襲 與NC、si-con組比較，si-SETD6組中SETD6蛋白水平顯著降低，細胞存活率、侵襲和遷移細胞數目顯著減少，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 沉默SETD6對肝癌Hep3b細胞中SETD6、CyclinD1、MMP-2的表達量和遷移、侵襲的影響

與NC、si-con組比較：1)P<0.05

圖3 Western 印跡檢測沉默SETD6對肝癌Hep3b細胞中CyclinD1、MMP-2的表達量

2.4miR-138-5p靶向SETD6抑制SETD6蛋白的表達 TargetScan生物信息學軟件預測顯示，miR-138-5p與SETD6 3'UTR存在結合位點，推測SETD6可能是miR-138-5p是靶基因；雙熒光素酶報告實驗顯示，Hep3b細胞中miR-138-5p-WT-SETD6組SETD6表達水平顯著降低。Western印跡進一步檢測 miR-138-5p對SETD6蛋白的影響，與miR-con組(0.96±0.04)比較，過表達miR-138-5p的Hep3b細胞中SETD6蛋白水平顯著下降(0.37±0.07，P<0.05)，與anti-miR-con組(0.87±0.11)比較，抑制miR-138-5p的Hep3b細胞中SETD6蛋白水平顯著升高(1.91±0.13，P<0.05)。見表4，圖4。

表4 miR-con或miR-138-5p與報告質粒共轉染肝癌Hep3b細胞后雙熒光素酶活性檢測

與miR-con組比較：1)P<0.05

A：miR-138-5p和SETD6的3'UTR結合位點；B：Western印跡檢測肝癌Hep3b細胞中SETD6的蛋白表達結果;1～4:miR-con組、miR-138-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-138-5p組圖4 miR-138-5p靶向SETD6抑制SETD6蛋白的表達

2.5過表達SETD6逆轉miR-138-5p抑制肝癌細胞遷移、侵襲 與miR-con組比較，過表達miR-138-5p后，miR-138-5p組SETD6蛋白水平顯著降低，細胞存活率、侵襲和遷移細胞數目顯著減少，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與miR-138-5p+pcDNA組比較，過表達SETD6后，miR-138-5p+pcDNA-SETD6組SETD6蛋白水平顯著升高，細胞存活率、侵襲和遷移細胞數目顯著升高，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表5，圖5。

2.6miR-138-5p靶向SETD6基因對Raf/MEK/ERK信號通路的影響 與miR-con組比較，過表達miR-138-5p后，miR-138-5p組Raf、p-MEK、p-ERK蛋白水平顯著降低，與miR-138-5p+pcDNA組比較，過表達SETD6后，miR-138-5p+pcDNA-SETD6組Raf、p-MEK、p-ERK蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表6，圖6。

表5 過表達SETD6和轉染miR-138-5p對肝癌Hep3b細胞中SETD6、CyclinD1和MMP-2的表達量及細胞侵襲遷移的影響

與miR-con組比較：1)P<0.05；與miR-138-5p+pcDNA組比較:2)P<0.05；表6同

1～4:miR-con組、miR-138-5p組、miR-138-5p+pcDNA組、miR-138-5p+pcDNA-SETD6組，圖6同圖5 Western 印跡檢測肝癌Hep3b細胞中SETD6、CyclinD1和MMP-2的表達

表6 miR-138-5p靶向SETD6基因對Raf/MEK/ERK信號通路中Raf、p-MEK、p-ERK的蛋白質表達量的影響

圖6 Western印跡檢測miR-138-5p靶向SETD6基因對Raf/MEK/ERK信號通路中Raf、p-MEK、p-ERK的蛋白表達的影響

3 討 論

肝癌是常見的癌癥類型，與其他類型癌癥相比，肝癌進展快速，是引起癌癥死亡的主要原因〔8〕。目前對于肝癌的治療主要包括手術、化療、放療、激素治療和靶向治療，但是耐藥性和腫瘤細胞復發轉移仍然影響患者的預后生存時間。所以尋找新的靶向治療分子，探究其作用機制對肝癌的治療具有重要意義。

miRNA 是內源性非編碼小RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因3'UTR結合，調控靶基因mRNA水平的表達。miRNA參與腫瘤的發生、發展過程〔9〕。乳腺癌細胞中，mir-138-5p水平顯著降低，mir-138-5p以LIMK1為靶點抑制細胞的增殖、侵襲和遷移〔10〕。mir-138-5p抑制宮頸癌、胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移〔11〕。本研究結果與上述研究結果一致。研究報道，過表達mir-138-5p可抑制子宮癌、胰腺癌、結直腸癌細胞的發生與發展〔11〕。mir-138-5p通過靶向ZEB2抑制肺腺癌細胞上皮-間質轉化、增殖和轉移〔12〕。miR-138-5p通過靶向BIRC5抑制了膀胱癌細胞的增殖和侵襲特性〔13〕。mir-138-5p在癌細胞中低表達，過表達抑制癌細胞增殖、遷移侵襲〔14〕。本研究提示過表達miR-138-5p 可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤組織的生長。

本研究還發現，肝癌細胞株中SETD6水平顯著高于正常肝細胞，其可能參與肝癌的疾病進展過程。SETD6屬于組蛋白甲基轉移酶中有SET結構域的蛋白，該家族具有高度統一保守性的SE結構域。研究顯示，SETD家族蛋白在多種細胞中表達，且與多種腫瘤的發生發展密切相關〔15〕。SETD6在乳腺癌細胞中高表達，SETD6表達缺失，引起細胞的生殖缺陷。SETD6催化WDR5的賴氨酸207和325甲基化促進肝癌細胞的增殖和遷移〔16〕。在多個肝癌細胞系中沉默SETD6，可抑制細胞增殖，同時細胞周期抑制劑CDKN1A的表達增強，誘導細胞凋亡〔17,3〕。本研究結果提示抑制SETD6蛋白的表達可抑制細胞的增殖、侵襲和遷移，與上述研究結果一致。

TargetScan生物信息學軟件預測顯示miR-138-5p 與SETD6有特異性互補序列，雙熒光素酶基因報告、Western印跡進一步驗證顯示miR-138-5p 可通過與SETD6 3'UTR區域直接結合負性調控SETD6的表達。進一步驗證miR-138-5p 靶向SETD6對肝癌細胞的影響，在穩定高表達miR-138-5p 的基礎上過表達SETD6基因，結果顯示，細胞存活率、侵襲和遷移細胞數顯著升高，提示過表達SETD6基因可逆轉高表達miR-138-5p 對肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲的抑制作用，進一步證實SETD6是miR-138-5p 的靶基因。

Raf/MEK/ERK信號是可被廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，該通路可傳遞細胞信號，引起細胞內特異蛋白的表達變化〔18〕。研究報道，Raf/MEK/ERK通路促進多種腫瘤細胞生長、增殖〔19〕。本研究提示過表達miR-138-5p抑制Raf/MEK/ERK通路的激活，抑制細胞增殖，可通過調節SETD6表達激活Raf/MEK/ERK通路。從機制上講，miR-138-5p調控SETD6的表達調控Raf/MEK/ERK通路，抑制肝癌細胞的增殖和遷移。