Nobiletin 對慢性低灌注損傷后小鼠腦海馬神經血管單元的影響

趙宇紅 陳世堅 李坤平 鄭凌云

(廣東藥科大學 1藥學院，廣東 廣州 510006；2生命科學與生物制藥學院)

慢性腦缺血是引起老年腦認知障礙的主要原因，研究表明，慢性腦缺血發(fā)生后，腦內神經血管的穩(wěn)態(tài)失衡，繼發(fā)的局部代謝障礙和蛋白代謝異常均可損傷神經血管單元各組分，引起血管性癡呆、阿爾茨海默病等認知障礙性疾病的發(fā)生〔1，2〕。川陳皮素(NOB)為傳統(tǒng)中藥陳皮中提取到的一種多甲氧基黃酮類化合物，脂溶性好，易于吸收和進入中樞。研究表明，NOB可減輕缺血再灌注腦血管損傷，抑制腦內炎癥反應，具有神經營養(yǎng)活性〔3〕，但NOB對腦慢性腦缺血的認知改善及其神經血管單元保護機制研究報道較少見。本實驗利用慢性低灌注模型，觀察NOB對慢性低灌注環(huán)境下海馬區(qū)神經血管單元的影響及機制。

1 資料及方法

1.1實驗動物 8周齡SPF級昆明小鼠，重20～30 g，購自廣東省實驗動物中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心SPF飼養(yǎng)室，自由攝食和飲水，12 h光暗交替，相對濕度55%，溫度為22～24℃。適應1 w后進行實驗。

1.2分組與處理 隨機將小鼠分為假手術組、模型組、NOB低劑量組〔(25 mg/(kg·d)〕、高劑量組〔50 mg/(kg·d)〕各10只。造模前12 h禁食，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，臥位固定，參照文獻方法〔4〕，沿頸正中切口切開皮膚，分離肌肉，暴露頸總動脈，結扎雙側頸總動脈，假手術組不結扎，藥物組于造模前3 d開始給予藥物腹腔注射，術后繼續(xù)給藥2 w，其余各組給予等量生理鹽水。實驗完成后，同前法麻醉，打開顱骨，迅速取出腦組織，置于冷的D-hank液中，冰上分離海馬，去除表面血管膜，置液氮中速凍，-80℃保存。

1.3藥品與試劑 NOB、水通道蛋白(AQP)4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒及 Laminin ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司，Claudin-5 ELISA試劑盒自購武漢華美生物工程有限公司，海馬區(qū)神經元生長相關蛋白(GAP)-43、突觸素(SYN)多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自Abcam公司，RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、RNA聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自寶生物工程公司，其他常用試劑購自廣州賽哲生物科技股份有限公司。

1.4曠場實驗〔5〕實驗敞箱為40 cm×40 cm×40 cm大小，箱底部分為16格區(qū)域，將小鼠面朝墻置于箱角暗區(qū)，讓其自由探索環(huán)境10 min，每只接受1次測試，測試結束后，清水清洗場地并擦干，箱頂用攝像儀記錄內小鼠活動總路程及中央?yún)^(qū)停留時間。

1.5Y迷宮實驗 ①新異臂探索實驗：用隔板擋住新異臂，小鼠由起始臂末端放入，讓其自由活動10 min，訓練結束放回籠，1 h后進行測試，測試時取出新異臂隔板，讓其自由活動5 min，記錄其活動情況；②電刺激測試：Y迷宮以亮燈臂為安全區(qū) (不通電)，其他區(qū)均為非安全區(qū) (電擊區(qū)) 。安全區(qū)隨機變換，亮燈延遲5 s進行電擊，以立即逃往安全區(qū)為一次正確反應，連續(xù)9次正確反應即為學會。實驗中，將小鼠置于迷宮中適應3 min，記錄其學會所需的訓練次數(shù)，24 h后進行記憶保持能力的檢測，以正確反應次數(shù)占總檢測次數(shù)的百分比表示 (正確反應次數(shù)/總檢測次數(shù)×100%)。

1.6腦海馬組織分離及蛋白提取 根據(jù)文獻方法〔6〕，小鼠麻醉后，迅速取出腦組織，冰上分離兩側海馬，用冰的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后液氮速凍研碎，加入蛋白裂解液中裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，Bradford法測定蛋白含量。

1.7Western印跡法測定蛋白表達 采用Bio-Rad小型垂直電泳轉印系統(tǒng)(美國)，將提取的海馬組織蛋白按5∶1比例加入4×十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液，100℃沸水變性3～5 min，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)2 h，半干法轉膜35 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入小鼠抗SYN、小鼠抗GAP-43、小鼠抗AQP-4及 Claudin-5，β-Tublin為對照，4℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次×10 min，HRP-抗小鼠IgG室溫孵育1 h，同前法漂洗，膜上加電化學發(fā)光(ECL)熒光顯影液，暗室曝光，室溫顯影、定影，沖洗膠片，用Image J program進行灰度分析。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、最小顯著差異檢測，如方差不齊，經秩和轉換后按前法進行。

2 結 果

2.1曠場實驗測試 模型組自由活動總時間較假手術組稍下降，NOB組自由活動情況有增加，但無顯著性差異(P>0.05)。模型組中心區(qū)活動時間與假手術組相比明顯降低(P<0.05)，NOB組與模型組相比中心區(qū)活動時間延長，但僅NOB高劑量組差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組自由活動時間的

與模型組比較：1)P<0.05;下表同

2.2Y迷宮刺激實驗測試 與假手術組相比，模型組達學會所需訓練次數(shù)明顯增加，訓練后正確率明顯下降(P<0.05)。NOB組與模型組相比，所需訓練次數(shù)減少，訓練后正確率下降，僅高劑量組差異顯著(P<0.05)，見表2。提示NOB高劑量對學習能力及記憶力均有改善作用。

表2 各組Y迷宮訓練學會次數(shù)及正確反應率

2.3各組海馬區(qū)神經元可塑性相關蛋白表達 與模型組比較，假手術組GAP-43及SYN蛋白表達顯著高，NOB高、低劑量可顯著增加海馬區(qū)GAP-43及SYN蛋白的表達(P<0.05)，其中NOB高量組對蛋白表達的促進作用更顯著。見表3，圖1。

表3 各組海馬GAP-43及SYN蛋白表達

圖1 各組海馬GAP-43及 SYN蛋白表達

2.4各組海馬區(qū)血腦屏障功能變化 與模型組比較，假手術組AQP-4、Claudin-5蛋白表達顯著高，NOB高、低劑量組均可顯著增加海馬區(qū)AQP-4及Claudin-5蛋白的表達(P<0.05)，其中，高劑量組對蛋白表達的增加作用更顯著。見表4，圖2。

表4 各組海馬AQP-4及Claudin-5蛋白表達

圖2 各組海馬AQP-4及Claudin-5蛋白表達

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)CCH不影響小鼠的自主活動情況，但可降低小鼠的探索能力和學習記憶能力，而NOB可明顯改善這一現(xiàn)象。

神經血管單元是腦結構和功能的基本單位，腦內神經元與膠質細胞、血管組成的微環(huán)境的改變都可影響腦的功能〔7〕。 海馬是與認知記憶相關的重要腦區(qū)，海馬神經細胞突觸可塑性的改變是認知記憶減退的主要原因。GAP-43及 SYN蛋白與突觸可塑性密切相關，GAP-43高表達于突觸發(fā)生的神經元突觸前膜，與突觸聯(lián)系的建立及突觸的損傷修復過程關系密切〔8〕。SYN蛋白位于突觸小泡囊泡膜上，SYN基因敲除小鼠在行為學實驗中表現(xiàn)出明顯的學習記憶功能損傷〔9〕。本實驗結果顯示，CCH可使GAP-43及SYN蛋白表達下調，而NOB可通過增加海馬區(qū)GAP-43及SYN蛋白的表達來調節(jié)神經突觸可塑性，改善慢性腦缺血的學習記憶損傷。

AQP-4在腦內廣泛分布于海馬齒狀回、腦血管表面及神經元與突觸接觸的膠質細胞，在血管周圍膠質細胞上呈極性分布的AQP-4表達多與水分子流動及腦水腫有關。研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)AQP-4的表達與神經可塑性相關，腦片離體培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，AQP-4敲除可引起海馬區(qū)θ波誘導的長時程增強受損及下調谷氨酸轉運體1的表達，減少星形膠質細胞對谷氨酸的重攝取，使谷氨酸興奮性突觸過度激活，使突觸可塑性受損，并影響相關學習記憶行為〔10，11〕。本實驗結果表明NOB對CCH的學習記憶損傷的改善作用，可能與海馬AQP-4增高相關的海馬神經可塑性表達有關。

Claudin-5蛋白是腦內構成內皮細胞緊密連接的主要蛋白，血腦屏障(BBB)通透性與Claudin-5的表達密切相關。動物研究表明，缺血后內皮間結構受損可使其表達下降，影響B(tài)BB的通透性，是神經血管系統(tǒng)屏障功能紊亂的標志蛋白〔12，13〕。本研究顯示，NOB可抑制CCH模型海馬Claudin-5的下調，改善由慢性腦缺血引起的BBB的功能紊亂。

總之，NOB可能通過影響神經血管單元的多個靶點，提高神經可塑性，調節(jié)神經血管系統(tǒng)功能，在慢性腦缺血腦損傷中發(fā)揮腦保護作用。