腫瘤甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷抑制人皮靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及生長因子受體2

陳涵 李鼎鵬 鄭先麗

(1甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2甘肅省中醫(yī)藥研究院；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

目前認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生是由多種因素導(dǎo)致的，這些自身基因和外在因素共同作用使人體細(xì)胞的DNA遭受非凋亡性損害，此過程會(huì)使?jié)撛诘闹掳┖鸵种颇[瘤滅活基因被激發(fā)，此時(shí)正常基因也會(huì)起到干預(yù)和阻滯作用，但在這過程中正常細(xì)胞逐漸發(fā)生癌性改變。我國惡性腫瘤每10萬人發(fā)生人數(shù)為285.91人，其中總體發(fā)病人群60歲以上超過3/5，城市發(fā)病率比農(nóng)村高20%，而農(nóng)村的死亡率卻比城市高8%〔1，2〕。

國家癌癥中心最新發(fā)布的包含了全國所有癌癥登記點(diǎn)的數(shù)據(jù)中指出，患病男性主要暴露因素為生活習(xí)慣、職業(yè)環(huán)境、各種壓力等相關(guān)因素〔3〕。而對(duì)于腫瘤的研究，諸多研究者發(fā)現(xiàn)血管生成與其緩慢發(fā)展和逐漸擴(kuò)散關(guān)系非常緊密，當(dāng)周徑<2 mm時(shí)，腫瘤只有原發(fā)部位的浸潤，呈潛伏性；當(dāng)腫瘤>2 mm時(shí)，血管會(huì)逐漸形成，并伴隨轉(zhuǎn)移發(fā)生，新生血管的數(shù)目和增長速度決定了腫瘤的生長和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移程度，可見新生血管形成對(duì)其的重要性〔4〕。基于上述理論，目前對(duì)腫瘤治療藥物的研究熱點(diǎn)主要聚集在新生血管抑制劑上，腫瘤新生血管系統(tǒng)是由多種細(xì)胞參與的綜合復(fù)雜過程，但這個(gè)過程最初的形成是由血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)進(jìn)行的，因此對(duì)其進(jìn)行最初的阻斷是阻止腫瘤生長的最初環(huán)節(jié)〔5〕。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，依靠活性降低來抑制甲基化基因，調(diào)節(jié)其表觀調(diào)控，抑制新生血管發(fā)生和分化，以此抑制腫瘤〔6〕。本研究從腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的新生血管出發(fā)，通過發(fā)揮5-Aza-CdR去甲基化功能抑制其最初始的血管EC來防治腫瘤發(fā)生。

1 材料與方法

1.1試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，貨號(hào)：120704491600)購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品(上海)有限公司美國。DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：26406.02)、胎牛血清(貨號(hào)：F7305)、基質(zhì)膠(貨號(hào)：526234)、胰蛋白酶(貨號(hào)：SH35042.01)購自GIBCO；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢博士德生物科技有限公司(貨號(hào)：SH30256.01)；噻唑藍(lán)(MTT)粉(貨號(hào)：88417)、Transwell小室(貨號(hào)：CLS3583)和5-Aza-CdR(貨號(hào)：HPBIO163803)購自SIGMA公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(thermo fisher公司，貨號(hào)：T2234)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)：WB0135)和超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(貨號(hào)：WB0164)購自上海維奧生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自必拓生物(貨號(hào)：K12001S)。

1.2儀器 實(shí)驗(yàn)室級(jí)純水系統(tǒng)(millipore，Milli-Q Integral)；超凈工作臺(tái)(蘇州億博，SZY3-12)；高速低溫冷凍離心機(jī)(GE，5804R)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，SY-25)；-80℃超低溫冰箱(Eppendorf，M450)；光學(xué)顯微鏡(OLMPUS，BX60)；電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京長風(fēng)儀器儀表公司，HH-8)；低速臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠，DS-2A)；垂直電泳儀(美侖，MH0430)；電轉(zhuǎn)移裝置(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，SE600)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC從液氮中取出放入提前預(yù)熱至37℃的水浴缽中，勻速晃動(dòng)，直至完全溶解后放置于超凈工作臺(tái)進(jìn)行操作。將廢液棄去，胰酶消化后，培養(yǎng)基吹打后，接種于培養(yǎng)瓶，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱，72 h換液1次。在顯微鏡下觀察細(xì)胞活性，在無污染的情況下，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶壁時(shí)進(jìn)行傳代，傳代時(shí)棄去廢液，吸取胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞皺縮快要脫落時(shí)棄去胰酶，加入DMEM培養(yǎng)基反復(fù)吹打，當(dāng)細(xì)胞全部懸浮后分裝到各培養(yǎng)瓶中，再加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境不變。各實(shí)驗(yàn)均將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、1、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR藥物組(低、中、高劑量組)。

1.4MTT法檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖作用 當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)，取對(duì)數(shù)生長期HUVEC，按照傳代步驟消化后吹打成細(xì)胞懸液，在離心機(jī)中1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基使HUVEC重懸，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中吸取10 μl細(xì)胞懸液，在倒置相差顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，將其濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml后在96孔板中接種，每孔吸入200 μl的懸液，每孔為2×104個(gè)，設(shè)置調(diào)零孔，檢測(cè)組每組10孔。每孔加入單純的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，為減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，在周圍孔每孔加入100 μl PBS。將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中過夜，然后棄上清，第1列含HUVEC培養(yǎng)孔和調(diào)零組的每孔加入無5-Aza-CdR的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。第2～4列孔中每孔分別加入5-Aza-CdR濃度為1、5、10 μmol/L的培養(yǎng)液100 μl。再次將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，在24、48、72 h時(shí)各取出樣本檢測(cè)1次，棄廢液，PBS洗滌后，加入完全DMEM培養(yǎng)基，每孔再加入 10 μl MTT，濃度為5 mg/ml，孵育4 h，棄去每孔液體，再加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，以1 500頻率震蕩10 min，融解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上調(diào)零后，檢測(cè)各孔的吸光度值(A490值)。

1.5Transwell檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)HUVEC細(xì)胞的遷移作用 傳至第3代的細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，用胰酶消化后加入完全DMEM培養(yǎng)基，混懸細(xì)胞，以1×105個(gè)/cm2密度接種于24孔的Transwell板上層培養(yǎng)小室中，每孔200 μl，在Transwell孔板下層培養(yǎng)小室中分別加入空白對(duì)照組完全培養(yǎng)液、1%含5-Aza-CdR的血清培養(yǎng)液、5%含5-Aza-CdR的血清培養(yǎng)液、10%含5-Aza-CdR的血清培養(yǎng)液，然后將其仍置于培養(yǎng)箱中，分別在24、48、72 h測(cè)細(xì)胞遷移。

1.65-Aza-CdR對(duì)HUVEC細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)的形成作用 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前1 d在超凈工作臺(tái)中鋪基質(zhì)膠，從-20℃冰箱中取出冷凍的冰袋，紫外線消毒15 min，基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基以1∶3的比例混勻后，以50 μl/孔加入96孔板，96孔板置于冰袋上，將其放入37℃恒溫箱中4 h后，轉(zhuǎn)至4℃冰箱中過夜。取對(duì)數(shù)生長期HUVEC，棄廢液，加入PBS沖洗1次后胰酶消化細(xì)胞，消化后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打制備單細(xì)胞懸液并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)。加入DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為濃度2×104個(gè)/cm2，將細(xì)胞吸取加入到之前鋪好基質(zhì)膠的96孔板中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)30 min后，分別加入10 μl含有5-Aza-CdR濃度為1、5、10 μmol/L的培養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中6 h后觀察小管形成并拍照。

1.7Western印跡檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)2的表達(dá)作用 細(xì)胞換液時(shí)各個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加入含1、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱過夜后在檢測(cè)孔中加入2 ml 4℃的PBS后晃動(dòng)洗滌1 min，棄去廢液后置于冰上，每孔加入裂解液100 μl，均勻來回?fù)u動(dòng)，裂解完成后用細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中反復(fù)吹打。高速低溫冷凍離心機(jī)預(yù)冷4℃下離心10 min(12 000 r/min)后收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩⒘呀庖篈與裂解液B以50∶1比例混勻后加入BCA工作液，37℃恒溫箱過夜穩(wěn)定。余步驟按照說明書操作后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(562 nm)檢測(cè)吸光值，計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。據(jù)目標(biāo)蛋白濃度，加入雙蒸水和5×上樣緩沖液后100℃滅活10 min，得到最終的蛋白樣品，配制的10%分離膠灌膠至綠帶中間線高度時(shí)即可，待濃縮膠凝固后加入電泳液，上樣量計(jì)算依據(jù)為檢測(cè)蛋白含量中含30 μg蛋白，同時(shí)加入蛋白Marker作為標(biāo)記，以連續(xù)系統(tǒng)中上層濃縮膠的電泳電壓為恒壓90 V，分離膠電泳電壓為恒壓160 V進(jìn)行電泳，完成后，在冰水中放入轉(zhuǎn)膜裝置并在295 mA條件下電泳1.5 h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。加入抗體稀釋液的稀釋磷酸化兔抗人VEGFR2(1∶1 000)，封口，4℃搖動(dòng)孵育過夜進(jìn)行孵育抗體雜交，然后進(jìn)行發(fā)光顯色。室溫孵育3 min后進(jìn)行壓片曝光，掃描膠片后通過圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶凈光密度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行Q檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)、DunnettT檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.15-Aza-CdR對(duì)HUVEC增殖的影響 高劑量組各時(shí)間點(diǎn)HUVEC的吸光度值顯著低于空白對(duì)照組和低劑量組(P<0.01)。低、中劑量組48、72 h的吸光度值顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，且中劑量組72 h的吸光度值顯著低于低劑量組(P<0.05)；見表1。提示在時(shí)間程度上，時(shí)間長短與HUVEC的抑制程度呈正相關(guān)，而且在最大時(shí)間限度內(nèi)藥物濃度越大對(duì)HUVEC的抑制作用越明顯。

2.25-Aza-CdR對(duì)HUVEC遷移的影響 不同濃度5-Aza-CdR在不同時(shí)間段能抑制HUVEC遷移，以高劑量組抑制效果最明顯。低、中、高劑量各時(shí)間點(diǎn)的HUVEC遷移均顯著小于空白對(duì)照組(P<0.01)。中、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)的HUVEC遷移均顯著小于低劑量組(P<0.05,P<0.01)，見圖1，表2。

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)各組HUVEC增殖值)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與低劑量組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

圖1 孵育24、48、72 h各組HUVEC遷移情況(臺(tái)盼藍(lán)染色，×200)

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間各組HUVEC遷移

2.35-Aza-CdR對(duì)HUVEC細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成的作用 不同濃度5-Aza-CdR在一定時(shí)間段內(nèi)對(duì)HUVEC細(xì)胞小管形成影響不同，小管形成能力隨5-Aza-CdR濃度的降低而增加(圖2)。細(xì)胞接種6 h后在基質(zhì)膠上排列形成類似于毛細(xì)血管的完整管腔。在不同濃度5-Aza-CdR作用下，HUVEC細(xì)胞成團(tuán)聚集，基質(zhì)膠上完整的管腔結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組相比顯著減少。與空白對(duì)照組比較，各劑量組小管形成完整的管腔結(jié)構(gòu)顯著減少；低劑量組6 h后管腔結(jié)構(gòu)被破壞，不時(shí)有斷裂出現(xiàn)，呈現(xiàn)一種不完整的、稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；中劑量組細(xì)胞管腔結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，斷裂擴(kuò)大，細(xì)胞不再聚集開始分散，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯；高劑量組幾乎沒有發(fā)現(xiàn)完整閉合的管腔形成，5-Aza-CdR對(duì)HUVEC細(xì)胞形成管腔能力的抑制作用則更明顯。提示，不同濃度5-Aza-CdR均可降低HUVEC小管形成能力，使小管周徑變小、成環(huán)率降低，高劑量組抑制作用最明顯。

圖2 各組HUVEC細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)生成活性(Brdu,×200)

2.45-Aza-CdR對(duì)細(xì)胞VEGFR2表達(dá)的作用 隨含藥濃度增加，細(xì)胞內(nèi)VEGFR2蛋白表達(dá)降低，見圖3。5-Aza-CdR可以明顯抑制VEGFR2蛋白表達(dá)，并與劑量濃度大小有正相關(guān)關(guān)系，濃度越大其抑制蛋白表達(dá)的作用也越明顯。

圖3 5-Aza-CdR干預(yù)HUVEC 24 h后VEGFR2表達(dá)

3 討 論

血管生成是腫瘤血管形成的經(jīng)典方式，它是原有血管在腫瘤細(xì)胞分泌的各種促血管生長因子的作用下，經(jīng)過一系列降解、EC增殖遷移導(dǎo)致形成新生血管的過程。雖然部分腫瘤的發(fā)生可以不伴有血管形成，但是因?yàn)槠渥畛醯脑话┯袧撛诼L的休眠期，此時(shí)期腫瘤體積很小只有幾立方毫米，但當(dāng)足夠數(shù)量的細(xì)胞從休眠表型轉(zhuǎn)變?yōu)檠芑硇蜁r(shí)，便會(huì)快速生長并會(huì)有轉(zhuǎn)移〔7〕。Folkman等〔8〕首次提出血管生成對(duì)于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要性，并由此推斷抑制腫瘤生長的有效措施可以是阻斷血管生成，在此機(jī)制中把腫瘤生長發(fā)生的機(jī)制歸結(jié)為腫瘤本身和依存的環(huán)境致使血管生成，主要是EC被刺激活化使拮抗因子平衡失調(diào)導(dǎo)致的過程，尤其會(huì)導(dǎo)致加速擴(kuò)散增殖。此策略觀點(diǎn)被后來的學(xué)者接受，并一致認(rèn)為腫瘤血管生成中EC的不斷增殖和遷移是極為重要的環(huán)節(jié)，并針對(duì)此機(jī)制研發(fā)了抑制EC的藥物，以此抑制腫瘤血管的生成。煙曲霉類似物TNP-470便是典型的腫瘤血管抑制劑，在臨床各種實(shí)體惡性腫瘤的遷移驗(yàn)證中取得了較好的療效〔9〕。研究證明EC通過增加自身的血管生成或增加腫瘤細(xì)胞遷移到細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲能力來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力〔10〕。而且研究已充分證明此種以EC為靶點(diǎn)來抵抗血管新生來抑制腫瘤細(xì)胞增殖是可行性極高的方式〔11〕。其主要表現(xiàn)為首先在腫瘤細(xì)胞刺激下的EC功能變化引起相關(guān)生化指標(biāo)的變化可通過血液系統(tǒng)獲得直接體現(xiàn)，有利于腫瘤的早期預(yù)測(cè)；其次，EC也是腫瘤藥物治療時(shí)最先到達(dá)的靶細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌化療時(shí)采用5-Aza-CdR進(jìn)行輔助可以改善藥敏降低，使細(xì)胞受到抑制和凋亡〔12〕。腫瘤血管的發(fā)生從單一細(xì)胞增殖開始逐漸發(fā)展為大量細(xì)胞增殖，新生血管會(huì)在原有基礎(chǔ)上快速增殖，通過細(xì)胞的不斷增殖來為HUVEC提供源源不斷的營養(yǎng)，而HUVEC反過來又會(huì)分泌多種物質(zhì)來促進(jìn)這個(gè)過程的加快，因此，抗血管生成首先就要抑制細(xì)胞增殖〔13〕。本研究提示，5-Aza-CdR在參與抑制血管生成過程的機(jī)制之一可能是抑制細(xì)胞增殖而起作用。

以含藥血清干預(yù)HUVEC來抑制其增殖和遷移使血管難以或者延遲生成，是依靠EC的黏附力降低以使EC損傷加快誘發(fā)腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移〔14，15〕。由此可見，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中血管生成起到很大的作用，抑制此過程將是治療的一個(gè)有效措施。本研究提示5-Aza-CdR可能是抑制細(xì)胞遷移而阻滯血管生成來防治腫瘤的發(fā)生。

腫瘤的血管形成過程是增殖-遷移-血管形成〔8〕。血管生成的過程雖然復(fù)雜，但是其主要途徑之一便是EC的活化、增殖和遷移，最后形成管樣結(jié)構(gòu)，在管樣結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)上，再由多個(gè)血管芽相互連接形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)〔16〕。因此，抑制血管形成中的管樣結(jié)構(gòu)，使其難以形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是阻滯腫瘤發(fā)生的重要步驟。本研究表明，5-Aza-CdR可顯著抑制HUVEC的管腔形成。

不論是原發(fā)性還是轉(zhuǎn)移性的腫瘤均有內(nèi)部因子失控的發(fā)生〔17〕。腫瘤在快速生長和侵襲周圍環(huán)境時(shí)需要較多的營養(yǎng)和有氧化條件，當(dāng)所在血管不能滿足發(fā)展時(shí)會(huì)激發(fā)腫瘤細(xì)胞生成促進(jìn)血管新生的因子，來改變局部環(huán)境利于其生長。在此過程中因?yàn)檫@些分泌的因子，EC會(huì)快速增殖、芽生，迅速形成管腔，以此建立連接功能性血供網(wǎng)為腫瘤提供充足的養(yǎng)分〔18〕。EC在新生血管的前端持續(xù)遷移以便于競(jìng)爭(zhēng)頂端細(xì)胞，而這種趨勢(shì)需要細(xì)胞內(nèi)環(huán)境信號(hào)的依賴〔19〕。通過腫瘤血管中EC前期研究，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)EC遷移是多種因子作用的結(jié)果，這些因子與其相應(yīng)的受體及靶細(xì)胞結(jié)合以此促進(jìn)遷移，來誘導(dǎo)血管新生，使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)便是影響EC遷移最重要的因子〔20〕。VEGF通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起EC增殖和遷移。內(nèi)皮頂端細(xì)胞在胞外VEGF誘導(dǎo)下，高表達(dá)的VEGFR2促使HUVEC更易于占據(jù)頂端位置〔21〕。而5-Aza-CdR還能干擾VEGFR2降低細(xì)胞能動(dòng)性，使作為血管生成因子在腫瘤血管生成中具有強(qiáng)大調(diào)節(jié)性的最活躍和最強(qiáng)特異性的VEGF受到阻滯，抑制腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)VEGFR2蛋白表達(dá)量顯著下降，其蛋白下降的程度與藥物濃度呈正比。

本課題組在前期研究的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR作為一種特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠抑制血液惡性腫瘤和多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞，有著廣譜抗腫瘤的作用〔22〕。因此，充分利用其抗腫瘤的廣譜性質(zhì)和去甲基化的作用，結(jié)合分子生物學(xué)研究藥物途徑抑制HUVEC的增殖、遷移、小管形成和血管因子受體蛋白的作用和表達(dá)，達(dá)到有效、安全、快速抑制惡性腫瘤細(xì)胞和治療腫瘤的目的，在目前的醫(yī)療水平階段有重要意義，是一種應(yīng)用前景良好且有效的抗腫瘤藥物。