基于生物信息學的骨關節炎差異基因譜預測

祝乃強 侯靜怡 劉金欣 馬桂云

(1承德醫學院附屬醫院脊柱外二科，河北 承德 067000;2承德醫學院)

骨關節炎(OA)多見于中老年人，65歲以上老年人患病率高達50%〔1〕。近年來，研究發現OA發病機制并不是一組靶點或一些基因間的相互作用關系出現了明顯改變，而是一組靶點或一些基因間的相互作用關系出現了明顯改變從而導致其相關功能模塊或生物網絡發生故障，其中包括軟骨細胞外基質的酶降解，新細胞外基質合成缺乏，細胞死亡與凋亡，軟骨細胞的異?；罨c分化等〔2，3〕。因此，尋找新的更有意義的生物標志物及其參加的信號通路，在預防與治療OA疾病發生和發展過程中起到重要作用。隨著高通量技術的快速發展，生物數據呈現指數級的增長，以基因芯片為代表的高通量生物檢測技術得到廣泛應用，其可在短時間內獲得大量的疾病相關基因信息，使得疾病在基因層面進行全面而細致的分析成為可能〔4〕。本研究采用生物信息學方法分析OA基因芯片數據，目的在于尋找OA病理過程中的關鍵基因及其參與信號通路，為OA早期診斷、早期治療干預、藥物研發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1數據收集與預處理 以“Osteoarthritis”作為檢索詞，在NCBI的基因表達匯編(GEO)數據庫檢索相應的基因芯片，下載符合實驗要求的4套數據集，其系列號為GSE12021、GSE55235、GSE55457和GSE55584，均來自GPL96平臺，芯片類型為Affymetrix Human Genome U133a芯片。GSE12021芯片數據集由Huber等〔5〕于2008年提交，該數據集包括13例正常滑膜組織樣本，20例OA組織樣本，20例類風濕性關節炎滑膜組織樣本；GSE55235、GSE55457和GSE55584數據集是由Woetzel等〔6〕于2014年提交的，共包含20例正?；そM織樣本，26例OA滑膜組織樣本，33例類風濕性關節炎滑膜組織樣本。本研究共選取4個數據集中的正?；そM織樣本和OA滑膜組織樣本作為后續分析的樣本。

1.2差異表達基因的篩選分析 利用R語言中的 “sva”分析包〔7〕對GSE12021、GSE55235、GSE55457和GSE55584數據集中的數據進行合并及批次校正，利用“limma”分析包〔8〕對上述4個數據集進行分析，以P<0.05，|log2FC|>1為篩選條件選擇數據集的差異表達基因。

1.3差異基因表達的基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 GO分析用于高通量基因組或轉錄組數據鑒定的生物學機制，包括分子功能(MF)、生物學過程(BP)、細胞組分(CC)〔9〕；KEGG 數據庫用于識別候選目標的功能及生物相關性〔10〕。本研究利用R語言中的“clusterProfiler”富集分析包〔11〕對差異基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.4蛋白-蛋白互作網絡(PPI)構建及關鍵基因分析(PPI) 將所有的差異基因導入到STRING線上數據庫(https：//string-db.org/)〔12〕，進行蛋白相互作用分析，并利用Cytoscape軟件對PPI進行可視化。應用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件對網絡進行拓撲學分析，以度值(degree)前10位的差異基因作為PPI中的關鍵基因。DisGeNET數據庫(http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/me，Version 5.0)〔13〕是包含與人類疾病相關的基因和變體的平臺之一。在 DisGeNET 數據庫中選用基因進行檢索，將上述靶點依次導入到數據庫中，獲取靶點類型信息(Protein Class)。

1.5關鍵模塊分析及功能富集分析 利用Cytoscape軟件中的插件復雜分子檢測(MCODE)對PPI進行模塊分析，標準設置：節點得分截止值=0.2，K核心值(K-Core)=2，度值截止=2，計算MCODE的得分值；以MCODE分數>6分作為顯著性模塊的篩選標準，并且利用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)在線數據庫對篩選出的模塊中的基因進行通路富集分析〔14〕。

2 結 果

2.1差異表達基因的篩選結果 GSE12021、GSE55235、GSE55457和GSE55584的數據集共包含33例正常滑膜組織樣本和40例OA滑膜組織樣本，篩選出符合條件的差異基因共320個，其中上調基因172個，下調基因148個。

2.2差異基因的GO功能富集和KEGG通路富集分析 將差異基因進行GO富集分析，其中上調的差異基因共有151個條目富集，主要包括加雙氧酶活動、鐵離子結合、細胞黏合力、泛素蛋白連接酶集合等，；下調的差異基因共有216個條目富集，主要包括抑制轉運因子結合、核苷酸糖跨膜轉運活動，激素受體結合等，詳細內容見圖1、圖2。

圖1 上調差異基因的GO功能富集分析

圖2 下調差異基因的GO功能富集分析

KEGG通路富集結果表明，上調的差異基因共有159個條目富集，主要包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、脂肪酸代謝通路、凋亡通路等；下調的基因共有133個條目富集，主要包括Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(JAK-STAT)信號通路、原發性免疫通路、造血細胞譜系通路等，詳細內容見圖3、4。

圖3 上調差異基因的KEGG通路富集分析

2.3PPI及關鍵基因分析 將篩選出的差異基因導入到STRING在線數據庫中，得到差異基因的PPI，該網絡包含313個節點，2 160條邊。如圖5所示，該網絡包含167個上調基因和144個下調基因。應用Cytoscape軟件的Cytohubba插件，分析網絡的拓撲學參數，且以degree值的大小表示該基因在此網絡中的重要性，如若degree越大，表明與其關聯的基因越多，則其基因越重要。

圖4 下調差異基因的KEGG通路富集分析

(白色節點代表上調基因，灰色節點代表下調基因)圖5 差異基因的蛋白-蛋白互相作用網絡

以degree前10位(degree > 40)的基因作為網絡的關鍵基因，所篩選的關鍵基因為：連環蛋白(CTNNB)1，糖原合成酶激酶(GSK)-3β，信號轉導和轉錄激活因子(STAT)1，Ras同系物集組成員(RHO)C，組蛋白去乙?；?HDAC)9，早老素(PSEN)1，賴氨酸脫甲基酶(KDM)5C，β-分泌酶(BACE)1，JAK 3和卡林蛋白(CUL1)；所涉及的OA過程中有信號通路、轉錄因子、蛋白(鈣結合蛋白)、酶(蛋白酶、激酶、酶調節劑、連接酶)。

2.4功能模塊分析 應用Cytoscape插件MCODE尋找差異基因PPI的關鍵模塊，其中符合MCODE得分大于4分的模塊共有3個，模塊1的MCODE得分為7.867，16個節點和59條邊。見圖6。模塊1中的基因進行功能富集分析，模塊1中基因主要參與6條富集通路，其中BP 3個條目，包括轉錄/DNA模板化、神經元分化負調劑、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調節；CC 1個條目-質膜外側和MF 2個條目，包括RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子序列、轉錄因子活性-DNA結合；KEGG通路富集分析顯示，模塊1中的基因主要參與5條信號通路，如JAK-STAT信號通路、趨化因子、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)信號通路等。見表1。

(淺色節點代表上調基因，深色節點代表下調基因)圖6 功能模塊的PPI

表1 功能模塊的功能富集和通路富集分析

FDR：錯誤發現率

3 討 論

OA是最常見的一種全關節疾病，肥胖、年齡、過度運動、炎癥、遺傳及創傷等多種因素與OA的發生密切聯系〔15〕。目前，OA的病因及發病機制尚不明確。分析OA的潛在發病機制對于診斷預后和鑒定藥物治療的靶點至關重要。由于高通量測序和微陣列技術可同時提供有關人類基因組中數千種基因表達水平的信息，因此該方法已廣泛用于預測OA的潛在診斷和治療靶點。

本研究進行差異基因分析表明OA發病機制的復雜性，其并不是簡單的單個基因/靶點單獨其作用，而是多基因/靶點相互作用的復雜結果。KEGG通路富集結果顯示，這些差異基因主要涉及MAPK信號通路，脂肪酸代謝通路，凋亡通路、JAK-STAT信號通路，原發性免疫通路，造血細胞譜系通路等。MAPK信號通路能夠調控軟骨細胞的增殖、凋亡、胞外基質代謝、炎癥因子分泌等過程，在OA病理過程中發揮重要作用〔16，17〕。Ge等〔16〕研究表明，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1可通過p38 MAPK信號通路促進OA的軟骨細胞凋亡。而Peng等〔18〕研究進一步發現OA中的雙特異性磷酸酶(DUSP)1過表達抑制了MAPK信號通路的激活和OA相關基質的表達。研究表明，JAK/STAT信號通路受到促炎細胞因子基因表達而顯著上調的調控。Lim等〔19〕研究表明，MMP-13在IL-1β處理的人軟骨肉瘤細胞系中的表達誘導了JAK2和STAT1/STAT2激活及MMP-13基因表達，其被泛酪氨酸激酶抑制劑AG490阻斷。然而，也有研究發現〔20〕，用IL-1β處理這種軟骨細胞系也激活了p38-MAPK/c-Fos/AP-1。

利用STRING在線數據庫對這些差異基因進行PPI網絡分析得到位于中心的關鍵靶點，其中，STAT1作為調節巨噬細胞炎癥反應中不可或缺的組成部分，如若激活的STAT1被磷酸并易位到細胞核中以上調炎癥的基因〔21〕。JAK3作為一種非受體酪氨酸激酶，可與細胞因子受體復合物的常見γ鏈(IL2RG)相互作用〔22〕。

PI3K-Akt信號通路對于生理和病理條件下細胞生長和存活的許多方面都至關重要〔23〕。研究表明，細胞內信號轉導途徑MAPK和PI3K-Akt已被證實在調節炎癥介質和骨關節炎發病機制中的細胞外基質改變中都是至關重要的〔24，25〕。其中IL-1β能夠激活MAPK的三種途徑(ERK，p38，JNK)及PI3K/Akt信號通路，隨著誘導分解代謝的表達，可進一步促進細胞外基質破壞〔26〕，表明MAPK和PI3K/Akt的調節在IL-1β處理的軟骨細胞中分解代謝因子和軟骨基質改變的調節中起關鍵作用〔27〕。趨化因子包含免疫細胞分泌的一小部分細胞因子或蛋白，且在免疫反應過程中調節和控制免疫系統細胞〔28〕。鑒于趨化因子在炎癥期間白細胞運輸和活化過程中起關鍵性作用，趨化因子很可能在OA的發育發揮重要作用〔29〕。研究表明，在OA液中檢測到許多趨化因子可以促進細胞類型的轉化，包括CCL1848和CX3CL1〔30，31〕。