基于中智相似積分算法心肌超聲造影系統(tǒng)自動(dòng)定量分析缺血再灌注大鼠存活心肌

孫智超，王 飛，張運(yùn)帷，王 爽，于海源，沈文茜，陳 雙，吳 言，郭延輝，田家瑋，杜國(guó)慶*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)心肌缺血機(jī)理與診療技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.美國(guó)伊利諾伊大學(xué)斯普林菲爾德分校計(jì)算機(jī)系，美國(guó) 伊利諾伊 62703)

急性心肌梗死(acute myocardium infarction， AMI)后及時(shí)恢復(fù)心肌供血可減少心肌細(xì)胞損傷，保護(hù)心臟功能，但大量研究[1-2]表明血管開通常會(huì)造成心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷。不同缺血時(shí)間再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌發(fā)生不同結(jié)局，且恢復(fù)血流灌注后，缺血心肌仍有部分雖然運(yùn)動(dòng)異常，但細(xì)胞依然存活，稱為存活心肌[3]。研究[4]顯示如果冠狀動(dòng)脈微循環(huán)受損嚴(yán)重，致存活心肌較少或缺失，即使開通阻塞的冠狀動(dòng)脈血管，心肌微循環(huán)仍無法恢復(fù)正常，預(yù)后無法改善。梗死心肌已無可挽救，但如存在存活心肌，則快速重建血運(yùn)非常有價(jià)值，而如何準(zhǔn)確識(shí)別存活心肌是臨床亟待解決的難題。心肌超聲造影(myocardium contrast echocardiography， MCE)可評(píng)估危險(xiǎn)心肌微循環(huán)灌注情況及其局部收縮功能，進(jìn)而較準(zhǔn)確識(shí)別存活心肌。目前依賴操作者主觀判斷分析MCE圖像，可重復(fù)性差。本研究采用本課題組研制的基于中智相似積分(neutrosophic similarity score， NSS)算法MCE分析系統(tǒng)識(shí)別大鼠存活心肌。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制備 健康雄性SD大鼠12只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量280～300 g，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg體質(zhì)量)麻醉后保定在固定板上，肢端連接心電儀，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，無菌條件下開胸，充分暴露心臟，剝開心包，于肺動(dòng)脈圓錐和左心耳下方2～3 mm前室間溝處結(jié)扎冠脈左前降支時(shí)，用自制軟管置于結(jié)扎環(huán)內(nèi)，建立缺血再灌注模型，體表連接同步心電圖，見ST段顯著抬高、結(jié)扎部位下部心肌變白、左心室前壁運(yùn)動(dòng)減弱為阻斷成功。阻斷30 min(I/R-30組，n=6)或45 min(I/R-45組，n=6)后松開結(jié)扎線，抽去軟管，結(jié)扎部位下心肌由發(fā)白變成紫紅色,為心肌I/R模型建模成功。

1.2 儀器與方法 采用GE Vivid7彩色多普勒超聲診斷儀，10S探頭，頻率8～11 MHz，分別于術(shù)前、阻斷即刻及再灌注后7、14及28天行MCE檢查。調(diào)節(jié)儀器至最佳顯示狀態(tài)并保持整個(gè)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不變。造影劑使用SonoVue(Bracco，Italy)，經(jīng)鼠尾靜脈以 0.05 ml/s推注稀釋造影劑，獲得左心室短軸切面(乳頭肌水平)造影視頻圖像，并將之存入光盤中用于圖像脫機(jī)分析。圖像納入標(biāo)準(zhǔn)：①無明顯聲衰減；②左心室短軸心肌呈圓形；③左心室腔造影劑微泡充盈均勻、飽滿；④左心室心肌灌注包括開始灌注-充盈-平臺(tái)期。12只大鼠行超聲造影共獲得MCE視頻60個(gè)，每組30個(gè)，所獲左心室短軸乳頭肌水平切面聲像圖圖像均符合納入標(biāo)準(zhǔn)。

采用基于NSS算法的MCE-NSS系統(tǒng)[5]從以下3個(gè)方面進(jìn)行分析。

1.2.1 自動(dòng)識(shí)別心、外內(nèi)膜邊界 ①計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算中智圖像的相似度；②運(yùn)用中智相似度完成圖像轉(zhuǎn)換；③均值聚類初始化超聲圖像區(qū)域；④利用水平集來迭代尋找心肌內(nèi)外邊界，自動(dòng)識(shí)別心肌區(qū)域(圖1)。

1.2.2 自動(dòng)合理分區(qū) 系統(tǒng)自動(dòng)從心腔圓心均勻發(fā)射射線，將心肌和心腔分為18個(gè)區(qū)(圖2)，自動(dòng)計(jì)算乳頭肌水平切面18個(gè)節(jié)段室壁增厚率(wall thickening， WT)及標(biāo)化造影劑灌注強(qiáng)度值(contrast intensity， CI)，WT=(左心室壁收縮末期厚度-左心室壁舒張末期厚度)/左心室壁收縮末期厚度。WT<0.3節(jié)段存在室壁運(yùn)動(dòng)減弱，標(biāo)化CI<-54Pix的區(qū)域?yàn)楣嘧⑷睋p區(qū)[6]。

1.2.3 危險(xiǎn)各區(qū)域評(píng)估 阻斷即刻將室壁收縮運(yùn)動(dòng)減弱或消失節(jié)段(WT<0.3)定義為危險(xiǎn)節(jié)段；再灌注后危險(xiǎn)節(jié)段劃分為3個(gè)區(qū)域：①WT<0.3且CI<-54 Pix為危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)；②WT<0.3且CI>-54Pix為危險(xiǎn)周邊區(qū)；③WT>0.3且CI>-54Pix為危險(xiǎn)恢復(fù)區(qū)。計(jì)算危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)、周邊區(qū)和恢復(fù)區(qū)各占左心室短軸乳頭肌水平切面整體節(jié)段的百分比，觀察阻斷即刻及術(shù)后7、14、28天時(shí)危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)、周邊區(qū)和恢復(fù)區(qū)面積變化情況。

圖1 NSS算法圖像處理流程 A.原始MCE圖像； B.中智相似度轉(zhuǎn)換圖像； C.中智活動(dòng)輪廓模型結(jié)果； D.尋找心內(nèi)膜邊界； E.尋找心外膜邊界； F.心肌最終分割結(jié)果

圖2 MCE-NSS系統(tǒng)分析流程 A.原始MCE圖像(阻斷后)； B.NSS算法分割后圖像； C.系統(tǒng)自動(dòng)將心肌和心腔分為18個(gè)區(qū)，并計(jì)算每個(gè)區(qū)心肌的WT和CI

1.3 病理學(xué)檢查 術(shù)后28天麻醉大鼠后行心臟灌流術(shù)，于心尖注射10%氯化鉀2～3 ml使心臟停止跳動(dòng)于舒張期，取出心臟。以甲醛溶液固定24 h后，沿左心室短軸將心肌均勻切分為5等分(厚約2～3 mm)。對(duì)所獲環(huán)狀心肌組織行Masson染色，計(jì)算梗死心肌面積；行免疫組織化學(xué)染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)毛細(xì)血管數(shù)量，每張切片隨機(jī)取4個(gè)視野取平均數(shù)，計(jì)算微血管密度(microvessel density, MVD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。連續(xù)性變量使用K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，采用±s表示符合正態(tài)分布的資料，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組內(nèi)比較采用單因素方差分析；以Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)面積與梗死面積及CI與MVD間的相關(guān)性，|r|≥0.8為相關(guān)性良好。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

12只大鼠均建模成功。

2.1 MCE-NSS系統(tǒng)評(píng)估危險(xiǎn)節(jié)段各區(qū)面積變化情況 術(shù)后7、14和28天，危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)百分比與阻斷即刻相比無明顯變化(P均>0.05)，而危險(xiǎn)周邊區(qū)面積逐漸縮小(P均<0.01)，危險(xiǎn)恢復(fù)區(qū)面積逐漸增加(P均<0.01)。I/R-45組危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)面積術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均大于I/R-30組(P均<0.01)，而2組危險(xiǎn)周邊區(qū)和恢復(fù)區(qū)面積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見圖3。

2.2 MCE-NSS結(jié)果與病理結(jié)果的相關(guān)性 Masson染色顯示I/R-30組梗死面積為12.66%，小于I/R-45組的24.72%(t=3.24，P<0.01)，MCE-NSS危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)面積百分比和Masson染色測(cè)得梗死面積百分比呈正相關(guān)(r=0.81,P<0.01)；危險(xiǎn)周邊區(qū)與恢復(fù)區(qū)均未見心肌壞死，證實(shí)為存活心肌，其中危險(xiǎn)周邊區(qū)即為頓抑心肌。見圖4。免疫組織化學(xué)染色顯示I/R-45組梗死周邊區(qū)MVD為20.88%，較I/R-30組22.94%明顯減少(t=2.26，P<0.05)，危險(xiǎn)周邊區(qū)CI值與MVD呈正相關(guān)(r=0.86,P<0.01)，見圖5。

圖3 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)危險(xiǎn)節(jié)段各區(qū)面積百分比比較 A.術(shù)后危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)面積百分比比較； B.術(shù)后危險(xiǎn)周邊區(qū)面積百分比比較； C.術(shù)后危險(xiǎn)恢復(fù)區(qū)面積百分比比較

圖4 Masson染色與MCE-NSS結(jié)果的相關(guān)性 A.心肌石蠟包埋； B.Masson染色(×200)； C.Masson染色計(jì)算心肌梗死面積和MCE-NSS危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)面積的相關(guān)性散點(diǎn)圖，二者呈正相關(guān)

圖5 免疫組織化學(xué)染色和MCE-NSS結(jié)果的相關(guān)性 A.I/R-30組免疫組織化學(xué)染色(×200)； B.I/R-45組免疫組織化學(xué)染色(×200)； C.免疫組織化學(xué)染色計(jì)算MVD與MCE-NSS計(jì)算的危險(xiǎn)周邊區(qū)灌注強(qiáng)度的相關(guān)性散點(diǎn)圖，二者呈良好正相關(guān)

3 討論

計(jì)算機(jī)輔助診斷基于計(jì)算機(jī)對(duì)醫(yī)學(xué)圖像進(jìn)行處理分析，以輔助影像醫(yī)師診斷，提高診斷準(zhǔn)確率。現(xiàn)有MCE分析主要依賴操作者主觀判斷，可重復(fù)性差，而計(jì)算機(jī)輔助診斷可彌補(bǔ)其缺陷。MCE-NSS系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)同時(shí)描記心內(nèi)膜及心外膜邊界，自動(dòng)計(jì)算WT及CI，進(jìn)而評(píng)估室壁運(yùn)動(dòng)及微循環(huán)情況[7]。

研究[8]表明，盡管及時(shí)開通阻塞血管，AMI患者仍會(huì)出現(xiàn)“低灌注”或“無復(fù)流”現(xiàn)象。MCE可定量評(píng)估心肌微循環(huán)灌注[9]。本研究應(yīng)用MCE-NSS系統(tǒng)觀察大鼠I/R模型危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)、周邊區(qū)及恢復(fù)區(qū)各時(shí)間點(diǎn)變化情況，發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)周邊區(qū)和恢復(fù)區(qū)CI值于術(shù)后7天時(shí)最低，術(shù)后14、28天逐漸升高，原因可能在于缺血區(qū)域及周邊心肌組織發(fā)生水腫、炎性改變等，影響了微循環(huán)血流灌注，心肌炎性反應(yīng)及水腫消退后，心肌血流灌注得到改善。I/R-30組缺血時(shí)間較短，危險(xiǎn)周邊區(qū)和恢復(fù)區(qū)CI值在術(shù)后14、28天基本恢復(fù)正常，與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而I/R-45組危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)CI值至術(shù)后28天仍低于術(shù)前，且始終低于I/R-30組，原因可能在于較長(zhǎng)缺血時(shí)間對(duì)心肌微循環(huán)結(jié)構(gòu)造成更為嚴(yán)重的損傷，如果危險(xiǎn)區(qū)域心肌微循環(huán)結(jié)構(gòu)受到不可逆破壞，會(huì)出現(xiàn)持續(xù)灌注缺損[10]。術(shù)后28天危險(xiǎn)周邊區(qū)CI與MVD呈正相關(guān)，提示MCE-NSS軟件能夠定量評(píng)估缺血后局部微循環(huán)灌注情況。

存活心肌是指因梗死或缺血而導(dǎo)致收縮功能異常，血流恢復(fù)后收縮功能逐漸恢復(fù)的心肌[11]，分為冬眠心肌和頓抑心肌[12]，主要表現(xiàn)為代謝、收縮功能及微循環(huán)灌注減弱。核素心肌灌注顯像是判斷存活心肌的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，通過放射性核素標(biāo)記對(duì)心肌灌注或代謝示蹤而評(píng)估心肌存活性，但僅為半定量分析，且價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用并不廣泛。負(fù)荷試驗(yàn)通過增加心臟負(fù)荷判斷心肌的收縮儲(chǔ)備功能，進(jìn)而判斷心肌存活，是判斷存活心肌較為常用的方法[10,12-13]，但多為半定量分析，且對(duì)AMI患者存在一定風(fēng)險(xiǎn)。MCE能評(píng)價(jià)心肌微循環(huán)情況，成本低、安全性高，是識(shí)別存活心肌較為理想的方法。應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件定量綜合評(píng)估CI和WT，可反映心肌微循環(huán)灌注情況和局部收縮功能。本研究I/R模型大鼠危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)微循環(huán)灌注和局部收縮功能直至術(shù)后28天仍有明顯降低，且均無法恢復(fù)，故判定該區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)域，且其面積與Masson染色測(cè)得梗死面積呈正相關(guān)，提示其所識(shí)別的危險(xiǎn)中央?yún)^(qū)面積可代表梗死心肌范圍。另外，術(shù)后隨時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，危險(xiǎn)周邊區(qū)面積不斷減小，由于周邊區(qū)界定標(biāo)準(zhǔn)是微循環(huán)灌注恢復(fù)而局部收縮功能仍然減低，故此區(qū)域?yàn)椤邦D抑心肌”[12]，即本系統(tǒng)通過識(shí)別危險(xiǎn)周邊區(qū)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)頓抑心肌的判斷，而危險(xiǎn)恢復(fù)區(qū)作為解除冠狀動(dòng)脈阻斷后迅速恢復(fù)微循環(huán)灌注和收縮功能的區(qū)域，可直接判斷為存活心肌區(qū)域。當(dāng)然危險(xiǎn)恢復(fù)區(qū)與正常心肌在細(xì)胞水平有所區(qū)別，如存在心肌細(xì)胞凋亡等；而正常心肌區(qū)域原本微灌注和室壁收縮運(yùn)動(dòng)均屬正常，判斷標(biāo)準(zhǔn)也是WT>0.3且CI>-54Pix，但超聲難以區(qū)別。

綜上所述，新型MCE-NSS系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)評(píng)估大鼠心肌I/R后左心室局部收縮功能及微循環(huán)情況，并能識(shí)別存活心肌。