蟲草素衍生物修飾納米金的制備及其生物活性研究

崔琳琳,王 瑩,雒江菡,袁 甜,魏思亦

(1.哈爾濱商業大學藥學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.黑龍江省預防與治療老年病藥物研究重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

蟲草素(3′-脫氧腺苷)是1951年經過Wu[1]等研究,從人工栽培的蛹蟲草的培養液中分離得到的一種核苷類似物。目前,蟲草素因其廣泛的藥理作用而受到了眾多學者的關注,現已成為抗衰老、保健、新藥研發等領域的熱門研究內容。現有研究結果證明了蟲草物種具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調節和腎臟保護等藥理作用[2-6]。納米金作為優良的載體,由于其具有表面易修飾性,通過絡合到其他化合物結構上增加其藥理活性,被越來越廣泛用于生物醫學研究中[7-13]。通過小分子絡合納米金可以減少傳統抗癌藥物對正常細胞的毒性,增加其抗癌作用效果[14-16]。納米金顆粒通過不同配體修飾后,使之可應用于檢測、靶向治療以及生物等一系列領域[16-18]。近年來,雖然國內外研究人員對蟲草素進行了一些研究,但是其藥理作用機制的研究還不夠深入,將蟲草素作為納米金的小分子修飾物方面尚缺少嘗試。蟲草素結構中含有-OH,故本實驗嘗試利用其結構中-OH修飾至納米金的表面,以期開發具有較高藥理活性的新型藥物。

圖1 化合物的合成路線Fig.1 Synthetic routes of compound

在本文的研究中,以蟲草素為母核,在5′位置上接入新的基團,制備了一個蟲草素衍生物(化合物B),通過提高脂溶性增加其活性。將化合物B作為小分子,制備了其修飾的納米金絡合物C。通過MTT實驗研究對HepG2細胞的抑制作用,并以革蘭氏陰性菌大腸桿菌,革蘭氏陽性菌枯草桿菌和金黃色葡萄球菌為研究對象,通過抑菌圈法進行抑菌活性研究,采用濁度法確定其最小抑菌濃度。以期為蟲草素衍生物抗腫瘤以及抑菌作用的深入研究和探索蟲草素衍生物在腫瘤治療應用方面的前景提供依據。蟲草素衍生物修飾納米金為今后研究小分子修飾納米金的合成手段提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲草素原料藥 純度>99%,湖北邦盛化工有限公司;2-呋喃甲酰氯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;吡啶 分析純,天津富宇精細化工有限公司;二氯甲烷 分析純,天津天力化學試劑有限公司;甲醇 分析純,天津天力化學試劑有限公司;氘代試劑-DMSO 北京金鷗翔;蒸餾水 實驗室自制;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) 北京欣經科生物技術有限公司;杜爾貝科改良的伊格爾培養基(DMEM) Hy Clone/Thermofisher;胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物有限公司;Hank’s平衡鹽溶液和胰蛋白酶消化液 GIBCO公司;人肝癌HepG2細胞株 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心;氯金酸 天津邁斯科;碳酸鈉 天津天力化學試劑有限公司;溴化鉀 天津天力化學試劑有限公司。

布魯克核磁共振波譜儀(500 MHz) 布魯克(北京)科技有限公司;UV-5200 PC紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;TECHAI-10透射電子顯微鏡 荷蘭PHILIPS;AL-Y3000X射線衍射儀 丹東奧龍射線儀器基團有限公司;FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科技發展股份有限公司;高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司;DL-CJ-1ND 醫用型超凈工作臺 中國北京東連哈爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物的合成 稱取2.259 g(0.009 mol)蟲草素(化合物A)溶于200 mL脫水吡啶中(40 kHz超聲波助溶5 min)。在磁力攪拌和氮氣保護下,分別將0.01 mol 呋喃緩慢滴入蟲草素的吡啶溶液中。保持溫度60～70 ℃,TLC監測反應進程,并在原料消失后終止。 然后通過旋轉蒸發器在95 ℃下將反應溶液濃縮成濃膏狀[19]。分別用30 mL二氯甲烷和水液混合,萃取三次,合并有機相,將上述合并的有機相用旋轉蒸發儀減壓蒸餾得到固體粉末樣品,采用干法上樣的方法,用少量硅膠粉末拌勻樣品,柱層析(甲醇∶二氯甲烷=1∶15),上硅膠柱(2 cm×75 cm玻璃柱,200～300目柱層析硅膠)得到化合物B。

在4 ℃預冷的40 mL的雙蒸水中,加入0.6 mL質量分數為1%的氯金酸;再加入0.2 mol/L的碳酸鈉溶液0.2 mL;在攪拌的條件下,迅速分批次加入新鮮配制的化合物B水溶液(質量濃度為0.5 mg/mL)0.4 mL,直至溶液出現酒紅色為止,磁力攪拌5 min,4 ℃靜置保存,得絡合物C溶液。

化合物產率計算:產率(%)=實際產量/理論產量×100

1.2.2 化合物的鑒定和表征

1.2.2.11H NMR和13C NMR鑒定化合物B的結構 二甲基亞砜(DMSO)用作溶劑溶解化合物A和化合物B,均以四甲基硅烷(TMS)為測定內標,通過500 MHz1H NMR和13C NMR對化合物B的結構進行確認。觀察化合B新增或減少的質子峰的種類和數量與目標化合物的吻合程度,從而判定新化合物B的結構。

1.2.2.2 分子量測定 將化合物B用色譜級乙腈超聲溶解,制備成濃度為100 μg/mL的溶液,進行質譜測定,確定分子量。質譜分析條件:電噴霧離子源,正離子掃描模式,毛細管電壓3.5 kV,噴霧電壓5500 V,霧化氣壓力0.11 MPa,輔助氣柱前壓68 kPa,干燥溫度450 ℃,干燥氣體流速為8.0 L/min。

1.2.2.3 紅外光譜分析 使用干燥的KBr壓片,傅立葉紅外分光光度儀測定蟲草素衍生物和蟲草素紅外光譜,觀察新化合物紅外色譜峰的變化情況,對化合物A、B和C進行表征。

1.2.2.4 UV光譜分析 以甲醇為空白對照,超聲助溶,對絡合物C進行紫外掃描(波長范圍0～600 nm),觀察絡合物C吸收波長的變化情況。

1.2.2.5 X射線衍射分析 將絡合物C溶液100 ℃烘干成干燥顆粒狀態后平鋪在載玻片上,進行X射線衍射圖(XRD)圖譜測定。

1.2.2.6 透射電子顯微鏡分析 使用透射電子顯微鏡(TEM)檢查膠體金顆粒的尺寸,將絡合物C滴在涂有碳的銅網上并真空干燥,然后在TEM下觀察。使用氯金酸還原的方法。 氯金酸被還原成金原子，由許多金原子組成積聚成膠體金溶液。利用TEM進行檢測,TEM圖像表明絡合物C顆粒的分散程度。

1.2.3 化合物的體外活性研究

1.2.3.1 體外抗腫瘤活性研究 細胞培養[20]:HepG2細胞解凍后,放入超凈工作臺,加入離心管內并加含有10%胎牛血清的DMEM培養液,混勻后1500 r/min離心20 min。棄去上清液,向離心管加入培養液,吹打制成細胞懸液。細胞計數,調細胞濃度為3×104cell/mL。將培養瓶放入37 ℃,5% CO2培養箱內培養,進行常規培養傳代。

MTT實驗:在體外抗腫瘤活性研究中,以人肝癌細胞HepG2為研究對象。采用MTT法檢測不同濃度的化合物A,化合物B和絡合物C對HepG2細胞增殖的影響。根據文獻方法[21],化合物A、B、C均制備成濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的溶液。細胞以 3×105個/mL接種量接種于96孔培養板,5% CO2,37 ℃溫箱中培養48 h后,每孔加入不同濃度的藥物各100 μL,繼續培養24 h、48 h,每孔6個平行孔。觀察到培養液變黃且細胞未長滿時,更換培養液。分別加入100 μL MTT(噻唑藍)后放回培養箱繼續培養4 h棄去培養基,加入150 μL DMSO,在酶標儀570 nm下讀板,根據測得的吸光度值,計算細胞生長抑制率,用分析軟件SPSS計算IC50值。

1.2.3.2 體外抑菌研究 抑菌實驗:含藥紙片的制備[22]:分別將大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌活化并將活化菌液濃度調制為1×108CFU/mL取100 μL加入滅菌后的固體培養基上,直徑為6 mm的圓型紙片滅菌后分別浸泡在化合物A、化合物B和絡合物C中。取出瀝干后放置平板上。37 ℃恒溫培養箱培養24 h。觀察結果,測定抑菌圈直徑。每組實驗重復3次。

絡合物C對三種菌的最小抑菌濃度實驗[23]:將絡合物C稀釋到無菌水中,制備成600 μg/mL原液,過濾后使用。二倍法稀釋藥物濃度。菌液濃度為1×108CFU/mL。將100 μL的含藥溶液加入到96孔板中每行的1～11孔內,第12孔不加藥物做空白對照。為了避免交叉污染,每塊96孔板只接取一種菌,為了降低邊緣效應,其他孔均加入100 μL無菌水和100 μL營養肉湯培養液。每組實驗須做三組重復。將96孔板放置恒溫培養箱37 ℃搖床孵育24 h判斷結果,酶標儀測定OD600。

1.3 數據處理

實驗中增值率用百分數表示,通過 SPSS 17.0 軟件進行統計學處理,相應的各組間比較采用LSD-t檢驗,P<0.05差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 化合物B的結構

所得到的化合物B為白色固體粉末,熔點197～198 ℃,產率為50.4%。

1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:8.26(1H,s,2-H),8.13(1H,d,8-H),7.98-6.70(3H,d,5′-CH=),5.93(1H,d,1′-H),5.77(1H,d,1′-H),4.69-4.24(4H,ddtd,2′-OH,4′-H,5′-CH2),2.06(2H,ddd,3′-CH2);13C NMR(126 MHz,DMSO-d6)δ:158.16(1C,-COO),156.52(1C,6-C),153.10(1C,2-C),149.47(1C,4-C),148.27-143.97(2C,5′-CH=),139.31(1C,8-C),119.44(1C,5-C),119.15-112.85(2C,5′-CH=),91.22(1C,1′-C),77.87(1C,4′-C),74.81(1C,2′-C),65.95(1C,5′-C),35.17(1C,3′-C). [M+H]+=346.1154 m/z.

2.2 絡合物C的結構

化合物A、B和C的紅外光譜如圖2所示,化合物A的紅外吸收峰:3141 cm-1是羥基的特征吸收峰,3337 cm-1是N-H的伸縮振動吸收峰,1341 cm-1是5′伯醇的羥基吸收峰[24]。 在圖中,化合物B的紅外吸收峰,產物在1740 cm-1處顯示出強吸收峰,而A在1740 cm-1處沒有明顯的吸收峰,這是5′羥基的特征吸收。在該圖中,絡合物C的紅外吸收峰,3455 cm-1是N-H的伸縮振動,1632 cm-1是C=N伸縮振動。C的峰值由于納米金偶聯的影響,峰值發生偏移。

圖2 紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum

絡合物C的UV光譜如圖3所示。在200～600 nm的波長范圍內掃描。這與納米金溶液的吸收特性最大吸收峰長為521 nm一致[25],可以確定復合溶液含有納米金顆粒。

圖3 絡合物C的UV光譜Fig.3 UV spectrum of complex C

絡合物C的X射線衍射分析結果見圖4。與JCPDS標準卡對照,可以看出樣品特征峰的2倍衍射角2θ值依次為5.70°、32.30°、46.20°處,出現的3個衍射峰均為Au的特征衍射峰,分別與面心立方(FCC)結構AuC(111),(200)和(220)晶面相對應,由此確定納米金。在不同放大倍數鏡像下觀察絡合物C的形態,結果見圖5所示,從圖中可見,粒子外觀圓整,大小均勻,分散性好。金顆粒為球型,基本不團聚。根據研究發現[26-27],Au簇自身具有電子結構,Au簇通過摻雜正電性元素或通過與穩定分子的親核位點與化合物所帶-OH官能團相互作用。由于氧陰離子在Au表面上的吸收增強了電子密度促進氧分子的吸收,自組裝單層包覆的Au-NPs與羥基進行吸附,Au核心的大量電子電荷轉移吸附到-OH上,從而Au和-OH基團之間形成復合物。由此推測化合物B中羥基為與納米金可能的絡合位點。

圖4 絡合物C的XRD Fig.4 XRD of complex C

圖5 絡合物C的TEM照片Fig.5 TEM photo of complex C

2.3 生物活性結果

圖6為三個化合物對HepG2細胞抑制率隨濃度變化曲線。如下圖所示,在一定濃度范圍內腫瘤抑制率的強度隨著藥物濃度的增加而增大。當藥物濃度為40～80 μg/mL時,絡合物C的抑制作用明顯優于化合物B。化合物A化合物B以及絡合物C的IC50值分別為39.41,39.01和36.61 μg/mL。在藥物濃度高于40 μg/mL時,絡合物C的抑制率明顯高于化合物A和化合物B,說明與納米金絡合后的絡合物C對HepG2細胞作用提升明顯。三個化合物對HepG2細胞均有抑制作用,其中絡合物C的抑制效果最佳。

圖6 藥物對HepG2細胞的抑制作用Fig.6 Inhibition of HepG2 cells by drugs

抑菌圈實驗結果見表1和表2。結果表明,絡合物C對大腸桿菌,枯草桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌作用。絡合物C對大腸桿菌的MIC值為30 μg/mL、枯草桿菌的MIC值為7.5 μg/mL和金黃色葡萄球菌的MIC值為30 μg/mL。因此,絡合物C對枯草桿菌的抑制作用效果最好。

表1 三種細菌的抑菌圈大小(mm)(n=3)Table 1 Inhibition ring size of three kinds of bacterias(mm)(n=3)

表2 絡合物C對三種細菌的MICTable 2 MIC of complex C to three kinds of bacterias

3 結論

我國是最早認識和利用蟲草的國家。但在蟲草素的研究和開發利用方面的水平還比較落后。本實驗以化合物A為原料,通過一系列的表征手段證明成功合成化合物B以及絡合物C并對其體外活性進行研究。通過MTT實驗研究發現二者對HepG2細胞的增殖均有明顯的抑制作用,并且發現藥物濃度為40～80 μg/mL時,絡合物C的抑制作用明顯優于化合物B。通過抑菌活性測試結果表明,二者對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌效果,絡合物C對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為30、7.5和30 μg/mL。因納米金顆粒具有良好的生物相容性,使得在人體內可以發揮很好的療效和作用。納米藥物技術的發展前景可觀,其具有巨大的發展潛力和實用價值,本文的研究將為新型創新藥物的研究提供一條思路。今后有望在人類疾病治療領域獲得應用。