綠原酸對熒光假單胞菌群體感應現象及其腐敗特性的抑制作用

王虹懿,吳海虹,張新笑,劉 芳,3,孫芝蘭,3,*,諸永志,王道營,徐為民,彭 景

(1.揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127;2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014;3.省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室,江蘇南京 210014)

細菌的群體感應也稱自身誘導,是指細菌通過產生和感應信號分子濃度的變化來檢測其群體密度,進而調控群體行為的過程。自身誘導物隨著細菌密度的增高而增高,當自身誘導物達到某一閾值后,會與一些轉錄調節子結合,從而誘導或抑制多種基因的表達。研究發現群體感應系統(quorum sensing system,QS)主要參與調控細菌胞外酶的分泌、毒力因子的表達和細菌運動等生理性狀[1-2]。經研究發現,大多數革蘭氏陰性菌通過QS機制分泌并感應酰基高絲氨酸內酯類分子類信號分子(N-acylhomoserine lactones,AHLs)來判斷菌群密度,并以此濃度閾值來調節細菌相關腐敗基因的表達,進而在食品腐敗過程中發揮致腐作用[3]。群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitors,QSIs)指對細菌間信息交流具有阻礙作用,干擾或抑制QS現象,且對細菌正常生命活動不造成破壞的物質。天然來源的QSI濃度低且毒性小,利用天然 QSI 阻斷細菌群體感應系統,降低腐敗菌致腐能力成為當前人類研究的熱點。研究發現阿魏精油作為一種新型的QSI可顯著抑制紫色桿菌的QS現象[4]。Chow等[5]報道了水楊酸對銅綠假單胞菌 QS 現象具有抑制作用,可有效降低其毒力效應。目前已從藥用植物、果蔬、海洋藻類中分離出具有抑制群體感應的天然活性物質。綠原酸是具有生物抑菌活性的天然植物源生物防腐劑[6],目前已有研究表明綠原酸對多種腐敗菌起到一定的抑制效果[7-8],但將其作為QSI研究其對腐敗菌致腐特性的影響卻鮮見報道。綠原酸作為新型植物源QSI與傳統的防腐劑相比,首先并不妨礙細菌的正常生長,僅在適當濃度時對靶細胞的QS系統起到調控作用,在避免細菌產生耐藥性的情況下抑制細菌腐敗因子的表達,降低細菌的致腐能力。

致腐微生物的生長是引起肉品腐敗變質的關鍵因素,其中假單胞菌屬通常被鑒定為肉類優勢腐敗菌,假單胞菌在冷鮮肉中的生長速率比其他細菌快三分之一左右[9-10]。熒光假單胞菌(P.fluorescens)為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌,是引起低溫條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質的優勢腐敗菌群[11]。細菌胞外蛋白酶、脂肪酶作為毒力因子在腐敗菌的侵染過程中起重要作用,可降解肉品中的蛋白質、脂肪等物質,產生多種腐敗代謝產物,進而使肉類食品風味和品質發生腐敗變性。因此,通過干擾或阻斷腐敗菌之間的信息傳遞來抑制其致腐特性的表達成為肉品保鮮領域重要的研究課題。本文以P.fluorescens為研究對象,探究綠原酸在不抑制其正常生長的條件下,對產生嗜鐵素、胞外蛋白酶、胞外脂肪酶、群集泳動等致腐特性的抑制作用,以期拓寬綠原酸在肉品防腐保鮮方面的應用范圍,為其作為天然群體感應抑制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株:熒光假單胞菌(P.fluorescens) 由江蘇省農業科學院農產品加工所自主從冷鮮雞肉中分離得到;紫色桿菌Chromobacteriumviolaceum026(CV026) 培養時需添加卡那霉素 20 μg/mL,由本實驗室保藏;綠原酸(杜仲提取物,98%) 陜西慧科植物開發有限公司;蛋白酶活性檢測試劑盒 索萊寶公司;AHLs類信號分子標準品(C4-HSL、C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、C12-HSL、C14-HSL) Sigma公司;無水甲醇(HPLC純) 國藥集團;脫脂乳粉、對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯、Tris-HCl、鉻天青S(CAS)、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA) 生工生物工程有限公司。

JY5002型電子天平 海良平儀器儀表有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;UniCenMR臺式高速冷凍離心機 德國Herolab公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;Ⅱ-ZX-40高效液相色譜串聯質譜分析儀 美國Aglient公司;Gen5全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸對P.fluorescens的最小抑菌濃度(MIC)及群體感應抑制活性的檢測 將菌株P.fluorescens過夜活化兩次后,按2%接種量接種于新鮮LB液體培養基中,培養至對數期后收集菌株,用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細菌重懸至OD600為0.5,按2%(V/V)的比例將菌懸液加入到LB液體培養基中混勻。采用二倍稀釋法,向上述培養基中加入綠原酸使終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL,28 ℃培養24 h后測定OD600,以抑制菌株生長的最低綠原酸的質量濃度為MIC。

報告菌株CV026過夜活化兩次,按2%的接種量接種于含有20 μg/mL卡那霉素的新鮮LB液體培養基中,于28 ℃搖床培養(180 r/min)至對數生長期,按2%接種量接種于含有20 μg/mL C4-HSL信號分子的LB半固瓊脂培養基,混合均勻后倒平板,待培養基凝固后緩慢放入牛津杯,杯中加入200 μL 1.5 mg/mL的綠原酸,以體積分數50%甲醇溶液作為空白對照,28 ℃培養24 h后觀察紫色素的產生情況。

1.2.2 綠原酸對P.fluorescens產信號分子AHLs的影響 AHLs粗提液的制備:活化后的P.fluorescens接種于LB液體培養基中,分別添加終濃度為1.5、2、2.5、3 mg/mL的綠原酸,以未添加綠原酸的液體培養基作為空白對照組。置于30 ℃搖床培養(200 r/min)12 h,12000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液,用等體積乙酸乙酯(含0.1 mL/L乙酸)萃取,吸出有機相,旋轉蒸發蒸干有機溶劑(35 ℃,真空度0.1 MPa),用甲醇充分潤洗蒸發瓶,所得甲醇溶液即為AHLs粗提液,-20 ℃保存。

AHLs的檢測:以甲醇為溶劑制備含有7種AHLs標準品的混合標準溶液,由HPLC-MS檢測確定各AHLs的保留時間,參照馬晨晨等[12]的方法設置色譜、質譜條件,將提取的AHLs粗提液做進一步鑒定。色譜條件:Waters Sunfire C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,3.5 μm);流速:0.2 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:35 ℃;流動相為甲醇∶水(50∶50,V/V)等梯度洗脫。質譜條件:離子源溫度:120 ℃,脫溶劑溫度350 ℃;脫溶劑氣和錐孔氣N2,脫溶劑氣流速500 L/h,錐孔氣流速50 L/h;毛細管電壓3.5 kV。樣品經C18色譜柱分離后進入質譜,采用電噴霧離子源正離子模式和多反應監測模式,外標法進行定量分析。

1.2.3 綠原酸對P.fluorescens生長曲線的影響 過夜活化得到的指示菌株按2%的接種量接種于LB液體培養基中,分別添加終濃度為1.5、2、2.5、3 mg/mL的綠原酸,設置未添加綠原酸的液體培養基作為空白對照組,添加C4-HSL信號分子為陽性對照組。將菌液置于28 ℃條件下200 r/min搖床培養,每隔1 h測定其OD600值,記錄并繪制生長曲線。

1.2.4 綠原酸對P.fluorescens腐敗特性的影響

1.2.4.1 CASAD嗜鐵素平板法檢測嗜鐵素含量 無菌上清液處理方法:將過夜活化的P.fluorescens菌株接種至含有不同濃度綠原酸(1.5、2、2.5、3 mg/mL)和添加外源C4-HSL信號分子(2 μg/mL)的LB液體培養基中,于28 ℃,200 r/min培養24 h后,4 ℃,12000 r/min離心2 min,吸取上清液并用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌備用。

嗜鐵素檢測平板配制參照參考文獻[13],待固體培養基凝固后緩慢放入牛津杯,每孔加入培養液上清200 μL,28 ℃培養24 h后觀察。由于嗜鐵素競爭結合培養基中的鐵,使杯周圍的培養基由原來的藍色變成黃色,黃色暈圈的大小代表菌株分泌嗜鐵素的含量。

1.2.4.2 綠原酸對P.fluorescens胞外蛋白酶活性的影響 本研究蛋白酶活性定性檢測參照文獻采用牛奶平板法[14],并稍做修改。本研究蛋白酶活性的定量檢測使用堿性蛋白酶試劑盒。

牛奶平板法:15%的脫脂乳粉用純水溶解后單獨滅菌(115 ℃,30 min),取10 mL脫脂乳與90 mL含0.85%瓊脂的LB半固態營養培養基混合均勻,傾注到水瓊脂平板中。待培養基凝固后緩慢放入牛津杯,每孔加入菌液上清200 μL,28 ℃靜置培養24 h后觀察其水解圈直徑,設置未添加綠原酸的液體培養基作為空白對照組,添加C4-HSL信號分子為陽性對照組。

蛋白酶含量測定:參照1.2.4.1方法制備菌液上清并過濾除菌,根據堿性蛋白酶活性檢測試劑盒說明書進行操作,測定680 nm處吸光度,按照蛋白濃度計算蛋白酶活性。

1.2.4.3 綠原酸對P.fluorescens胞外脂肪酶活性的影響 采用對硝基苯酚(p-NP)法進行脂肪酶活性的定量檢測[15],取90 mg對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPO)溶解于30 mL乙腈溶液中,作為底物溶液存于-20 ℃備用。取100 μL底物溶液加入900 μL 50 mmol/L的Tris-HCL緩沖液(pH8.0)中,搖勻后于37 ℃保溫5 min,然后向其加入50 μL適當稀釋的脂肪酶待測樣品,設置相應體積的滅活樣品作為空白對照,37 ℃振蕩反應5 min。反應結束后,立即加入300 μL 10%的三氯乙酸中止反應,搖勻后靜置5 min,加入300 μL 10% Na2CO3溶液,搖勻,于4 ℃,13500 r/min離心2 min,取反應液測定OD410值。1個酶活單位定義為:在37 ℃條件下,每分鐘水解p-NPO釋放1 μmol p-NP所需的酶量,以U表示。計算脂肪酶活性公式如下:

式中:X為脂肪酶活性,U·mL-1;c為p-NP濃度,μmol·mL-1;V為終止后總體積,mL;v為酶液用量,mL;t為反應時間,min。

1.2.4.4 綠原酸對P.fluorescens群集運動和泳動的影響 參照文獻[16]配制群集瓊脂培養基(1%蛋白胨(質量分數計,下同)、0.5%氯化鈉、0.5%瓊脂和0.5%葡萄糖)和泳動瓊脂培養基(1%胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.3%瓊脂),將不同濃度的綠原酸經0.22 μm的濾膜過濾除菌后,與冷卻至40 ℃的群集泳動瓊脂培養基混勻,倒平板,使平板中綠原酸的終濃度為1.5、2、2.5、3 mg/mL,設置未添加綠原酸的液體培養基作為空白對照組,添加C4-HSL信號分子為陽性對照組。向冷卻的平板中央加入5 μL過夜活化的P.fluorescens菌液,無菌風吹干后28 ℃靜置培養24 h,觀察供試菌株的遷移情況。

1.3 數據分析

每組實驗均設置3個平行并重復操作三次,結果均表示為平均值±標準偏差(n≥3),利用SPSS 16.0統計軟件,采用最小顯著差異法(LSD)分析均值的差異性,顯著性水平為0.05。使用分析軟件Origin 8.5進行作圖。

2 結果與分析

2.1 綠原酸的最小抑菌濃度及QSIs活性

采用二倍稀釋法觀察綠原酸濃度梯度為0.625～10 mg/mL時P.fluorescens和CV026菌株的生長情況,確定了綠原酸對P.fluorescens和CV026菌株的最小抑菌濃度均為5 mg/mL。因此,為保證后續實驗效果非綠原酸本身的抑菌作用,綠原酸濃度均設置為亞抑菌濃度[17],即1.5、2、2.5、3 mg/mL。

圖1表示在亞抑菌劑量下綠原酸對紫色桿菌CV026 QS活性的影響。紫色桿菌CV026紫色素的產生受其群體感應系統的調控,當存在信號分子時,其群體感應系統被激發,產生紫色表型[17];若樣品中含有群體感應抑制劑,則會抑制CV026產生紫色素的能力。圖1顯示,加入綠原酸的牛津杯周圍出現渾濁、不透明的抑制圈,表明綠原酸在不影響菌株生長的情況下,具有抑制CV026群體感應活性的能力。

圖1 綠原酸對紫色桿菌CV026紫色素產生的抑制作用Fig.1 Effect of hlorogenic acid on violacein production of CV026注:1:2.5 mg/mL綠原酸;2:50%甲醇溶液。

2.2 綠原酸對P. fluorescens產AHLs的影響

2.2.1 HPLC-MS/MS檢測AHLs標準品 HPLC-MS/MS在所述條件下分別對7種AHLs信號分子標準品進行檢測,得到AHLs混合標準品的色譜圖(圖2)。可以看出峰分離良好,C4-HSL、C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、C12-HSL、C14-HSL標準品保留時間分別為1.009、1.922、2.421、4.808、4.904、5.306和5.928 min。

圖2 AHLs混合標準品離子流圖Fig.2 Chromatograms of mixture of AHLs

2.2.2P.fluorescens釋放AHLs的檢測P.fluorescens所產生信號分子的種類為:C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL和3-oxo-C8-HSL。各類信號分子的質量濃度見表1,熒光假單胞菌分泌量較高的信號分子為C4-HSL和C6-HSL。與空白組相比,經綠原酸處理的實驗組釋放AHLs的種類未發生明顯變化,但隨著綠原酸濃度的增加,各AHLs質量濃度明顯下降,提示綠原酸能夠抑制P.fluorescens群體感應信號分子的表達或釋放,可能是抑制了信號分子合成酶基因(LuxR/LuxI)的表達,使AHLs的催化合成釋放減少。

表1 熒光假單胞菌AHLs信號分子水平(μg/L)Table1 The AHLs level of P. fluorescens(μg/L)

2.3 綠原酸對P. fluorescens生長曲線影響

對生長曲線進行測定能夠更加深入地觀察菌株的生長情況。由圖3可知,低于3 mg/mL綠原酸濃度處理的P.fluorescens與對照組的生長趨勢基本一致,0～2 h為細菌生長的遲緩期,2 h后開始進入生長對數期,經綠原酸處理的菌株生長稍緩于C4-HSL處理組和空白對照組,至12 h菌株生長趨于穩定,此時C4-HSL處理組的OD600值為1.40,空白對照組為1.41,添加1.5、2、2.5 mg/mL綠原酸的處理組OD600值分別為1.35、1.37、1.36,與空白對照組幾乎保持一致,菌株的生長水平并沒有受到明顯影響。而經3 mg/mL綠原酸處理的P.fluorescens生長明顯放緩,于3～4 h后開始進入生長對數期,在12 h時其菌體密度OD600為1.28。上述結果表明濃度低于3 mg/mL的綠原酸不影響P.fluorescens的生長,濃度到達3 mg/mL時能一定程度減緩P.fluorescens生長,但對最終的菌體濃度未造成顯著影響(P>0.05)。

圖3 綠原酸對熒光假單胞菌的生長曲線的影響Fig.3 Effect of chlorogenic acid on the growth curve of P. fluorescens

2.4 綠原酸對P. fluorescens腐敗特性的影響

2.4.1 綠原酸對P.fluorescens嗜鐵素產生的影響 嗜鐵素的產生是腐敗細菌拮抗競爭的一種方式[18],其作為P.fluorescens成為優勢腐敗菌的重要因子,主要通過對鐵離子的競爭影響其他細菌的生長。熒光假單胞菌產生的嗜鐵素絡合食品基質中的鐵離子,使其他微生物得不到足夠的鐵營養,生長發育受到抑制,從而使其能夠維持自身的菌體密度[19]。李婷婷等[3]發現AHLs對溫和氣單胞菌嗜鐵素產生具有調控作用。Stintzi等[20]報道了銅綠假單胞菌通過QS調控嗜鐵素的產生量。CASAD嗜鐵素平板法檢測P.fluorescens嗜鐵素暈圈,結果如圖4所示。相比對照組,添加外源C4-HSL時嗜鐵素水解圈直徑明顯增大,表示嗜鐵素生成量增多,而綠原酸處理組嗜鐵素的生成量明顯降低,且呈濃度效應關系。這表明綠原酸可能通過干擾P.fluorescens由AHLs介導的群體感應系統有效抑制嗜鐵素的產生,進而降低其致腐能力。

圖4 C4-HSL和綠原酸對熒光假單胞菌嗜鐵素產生的影響Fig.4 Effect of chlorogenic acid on the siderophore production of C4-HSL and P. fluorescens 注:1:C4-HSL;2:對照;3:1.5 mg/mL;4:2 mg/mL;5:2.5 mg/mL;6:3 mg/mL。

2.4.2 綠原酸對P.fluorescens蛋白酶活性的影響P.fluorescens是肉產品中主要的蛋白分解菌,具有產生高活性蛋白水解酶的能力[21]。其致腐機理是利用蛋白酶降解肉品中蛋白質,促進自身生長繁殖,同時產生異味和揮發性鹽基氮并使肉軟化,導致肉品風味和品質發生劣變,甚至產生有毒有害物質[22]。本文探究不同濃度綠原酸對P.fluorescens胞外蛋白酶活性的抑制作用,結果如圖5所示。與未添加綠原酸處理的對照組相比,C4-HSL處理組水解圈直徑更大,經綠原酸處理后蛋白酶水解圈直徑明顯減小,且水解圈直徑與綠原酸濃度呈負相關。

圖5 C4-HSL和綠原酸對熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig.5 The effects of C4-HSL and chlorogenic acid on extracellular protease activity of P. fluorescens注：1：C4-HSL；2：對照；3：1.5 mg/mL；4：2 mg/mL；5：2.5 mg/mL；6：3 mg/mL。

相關研究表明,細菌蛋白酶的分泌受到QS系統的調控[6],且通過添加姜油酮[23]、富馬酸鈉[24]等QSI發現,細菌胞外蛋白酶分泌量明顯降低。牛奶平板法能初步定性顯示蛋白酶的含量,為了定量細菌所產胞外蛋白酶,進一步確定受AHLs介導的QS系統是否參與調控P.fluorescens胞外蛋白酶的分泌,探究不同濃度綠原酸對P.fluorescens胞外蛋白酶活性的影響,采用蛋白酶試劑盒法檢測蛋白酶活性。結果如圖6所示,經外源C4-HSL誘導的細菌菌液上清中蛋白酶活性顯著高于包括空白組在內的其他處理組(P<0.05),高達0.834 U/mg prot,提示QS系統參與調控其胞外蛋白酶的產生。且隨著添加綠原酸濃度的升高,P.fluorescens胞外蛋白酶活性逐漸降低,除2和2.5 mg/mL綠原酸處理組間差異無統計學意義之外(P>0.05),其余綠原酸處理組之間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。綠原酸濃度為3 mg/mL時,胞外蛋白酶活性降低為0.26 U/mg prot。表明綠原酸可通過干擾AHLs介導的QS系統來抑制P.fluorescens胞外蛋白酶活性,且濃度越高,抑制作用越強。

圖6 C4-HSL和綠原酸對熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig.6 The effect of C4-HSL and chlorogenic acid on extracellular protease activity of P. fluorescens注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。

2.4.3 綠原酸對P.fluorescens脂肪酶活性影響 肉品中的腐敗菌能產生降解肌肉組織的脂肪酶,將甘油三酯降解為甘油或脂肪酸,從而改變禽畜肉組織結構導致腐敗。脂肪酶活性可能受到由AHLs介導的QS系統參與調控,為探究不同濃度綠原酸對P.fluorescens胞外脂肪酶活性的影響,采用p-NPP比色法測定不同處理菌株的脂肪酶活性,結果由圖7可知。通過比較分析發現,當C4-HSL存在時脂肪酶活性最高,達0.49 U/mL,其余實驗組酶活性均顯著低于C4-HSL處理組(P<0.05),提示其胞外脂肪酶的產生受到QS系統影響。各濃度綠原酸處理組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。其中經3 mg/mL綠原酸處理后P.fluorescens酶活性最低,僅為0.074 U/mL。說明綠原酸能明顯抑制熒光假單胞菌胞外脂肪酶活性,且濃度越高,抑制作用明顯。研究中發現P.fluorescens脂肪酶活性普遍偏低,可能與培養基和發酵等培養條件相關;其次有研究表明細菌脂肪酶的分泌需要同源分泌系統,但細菌脂肪酶基因一般受到嚴格的表達調控,其機制和途徑復雜,導致細菌脂肪酶(特別是假單胞菌屬脂肪酶)產量普遍不高[25]。

圖7 C4-HSL和綠原酸對熒光假單胞菌胞外脂肪酶活性的影響Fig.7 The effect of C4-HSL and chlorogenic acid on extracellular lipase activity of P. fluorescens

2.4.4 綠原酸對P.fluorescens群集與泳動的影響 群集和泳動作為細菌的兩種遷移方式,其區別在于前者是群體行為,指細菌在大于0.45%的瓊脂培養基上的表面遷移,后者則是一種個體行為,指細菌在小于0.45%的瓊脂培養基表面遷移[26-27]。細菌鞭毛介導的運動特性在定殖到宿主表面及后續生物被膜形成過程中起到重要作用[28]。細菌的運動性被證實在定植到宿主表面后菌體聚集導致微菌落及后繼形成生物膜的過程中發揮關鍵作用[29]。圖8、圖9為不同濃度下綠原酸對P.fluorescens群集與泳動的抑制效果圖。由圖8、圖9可以看出,添加C4-HSL的處理組菌株運動能力明顯強于對照組和其他任何濃度綠原酸處理的菌株,其群集與泳動直徑分別為27.26、30.10 mm,進一步說明了AHLs可調控P.fluorescens的運動能力,而經綠原酸處理后熒光假單胞菌的運動性受到明顯的抑制,且P.fluorescens群集和泳動運動特性與綠原酸的添加量呈負相關。表明P.fluorescens運動能力受群體感應系統調控,且綠原酸可能干擾了熒光假單胞菌鞭毛粘附至接觸面的能力[28],進而影響其致腐能力。

圖8 C4-HSL和綠原酸對熒光假單胞菌群集(a)和泳動(b)的影響Fig.8 The effects of C4-HSL and chlorogenic acid on swarming and swimming of P. fluorescens注：1：C4-HSL；2：對照；3：1.5 mg/mL；4：2 mg/mL；5：2.5 mg/mL；6：3 mg/mL。

圖9 C4-HSL和綠原酸對熒光假單胞菌運動區直徑和面積的影響Fig.9 The effect of C4-HSL and chlorogenic acid on diameter and area of the motility zone of P. fluorescens

3 結論

利用紫色桿菌CV026檢測模型證明了綠原酸具有群體感應抑制活性;綠原酸在不影響P.fluorescens正常生長的條件下明顯抑制了P.fluorescens與腐敗相關的生物特性。P.fluorescens這些腐敗特性的表達均受由信號分子介導的QS的調控,當添加3 mg/mL以下亞抑菌濃度的綠原酸時,嗜鐵素、蛋白酶活性、脂肪酶活性、群集和泳動能力均受到明顯的抑制,且隨著綠原酸濃度的增加,抑制效果更趨明顯。此外,HPLC-MS/MS檢測結果表明,綠原酸能夠有效降低P.fluorescensAHLs的釋放。因此推測綠原酸可能通過降解P.fluorescens信號分子的方式來阻斷P.fluorescens的群體感應系統,從而減弱其腐敗特性的表達,證實了綠原酸良好的群體感應抑制活性,但對其調節細菌AHLs的分泌進而抑制致腐能力的分子機制尚未明了,因此可以進一步解析綠原酸對腐敗菌QS系統的調控靶點及作用方式,為其作為新型QSIs的開發提供理論支撐,促進其在食品防腐保鮮中發揮優勢作用。