牦牛曲拉源乳酸菌的耐受性與抑菌性能比較

朱建寧,曹 磊,文鵬程,楊 敏,汪 月,張忠明,張衛兵,*

(1.甘肅省藥品監督管理局審評認證中心,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

傳統發酵乳制品中蘊藏著種類豐富的微生物,是益生菌的重要來源[1-3]。牦牛曲拉是將牦牛乳脫脂后,在自然條件下進行發酵使酪蛋白凝結、干燥后制成的一種發酵乳制品[4]。曲拉可以直接食用,而且也是牧民制作酸奶的發酵劑[5-7]。實驗室前期從牦牛曲拉中篩選得到了發酵性能優良的乳酸菌,但對其益生性能尚不明確。

乳酸菌要在腸道內發揮益生作用,必須能夠通過胃腸道并存活下來,因此需要對強酸、高膽酸鹽和高滲透壓具備一定的耐受性[8-10]。乳酸菌具有調節腸道菌群的作用,其抑菌機理是進入腸道后,通過黏附作用定殖于腸道并排斥其它病原菌的黏附,同時可產生多種抑菌成分用于保護腸黏膜上皮細胞免受其它病原菌帶來的損害[11-12]。有研究表明,乳酸菌通過自身代謝產生各種不同類型的有機酸、H2O2、二乙酰和細菌素等物質可以抑制胃腸道中的有害微生物生長繁殖[13]。臨床應用表明,乳酸菌可以有效治療腸道有害菌引起的腹瀉等疾病[9,14]。

本試驗以實驗室前期從牦牛曲拉中分離篩選的6株乳酸菌為研究對象,考察了它們的耐酸、耐膽鹽和耐滲透壓能力,同時研究了它們對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的抑菌性能。研究可為青藏高原極端環境條件下的傳統牦牛曲拉中乳酸菌種質資源的開發利用提供重要的科學依據和理論支撐,對牦牛曲拉源乳酸菌的工業化應用及乳酸菌發酵劑制備提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氫氧化鈉 天津市大茂化學試劑廠;鹽酸 天津市大茂化學試劑廠;牛膽鹽 上海中秦化學試劑有限公司;氯化鈉 北京中科百奧生物技術公司;MRS培養基、MRS肉湯培養基及LB瓊脂培養基 青島海博生物技術有限公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate belanced solution,PBS) 北京萬佳首化生物科技有限公司;胃蛋白酶(1∶10000) 北京賽而生物藥業有限公司;胰蛋白酶(1∶250) 北京聯立信生物技術有限公司;乳酸菌菌株:Q1嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、Q2耐久腸球菌(Enterococcusdurans)及G1、G2、G3、G4瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus) 甘肅農業大學食品科學與工程學院實驗室保藏;指示菌株:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌 甘肅農業大學食品科學與工程學院實驗室保藏。

SW-CJH-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YX-280A型高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;HG303-4型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器有限公司;754 PC型紫外可分光光度計 上海光譜儀器有限公司;AL 204型分析天平 上海Mettler-Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌耐酸能力測定 參照Gu等[15]的方法測定。將乳酸菌活化后以3%接種量接種到pH分別為2.5、3.5、4.5和6.5的MRS液體培養基37 ℃培養,在0、2、4、6、12和24 h時取樣,測定各菌株的OD600 nm值。用pH為6.5,接種量為3%的MRS液體培養基作為對照,以對應pH的液體培養基調零。重復三次試驗取平均值。

1.2.2 乳酸菌耐膽酸鹽能力的測定 參照Gu等[15]的方法進行測定。將乳酸菌活化后以3%接種量接種到牛膽鹽質量分數分別為0.0%、0.1%、0.3%和0.5%的MRS液體培養基37 ℃培養,在0、2、4、6、12和24 h時取樣,測定各菌株的OD600 nm值。用未添加膽酸鹽,接種量為3%的MRS液體培養基作為對照,以對應的膽酸鹽濃度液體培養基調零。重復三次試驗取平均值。

1.2.3 耐滲透壓能力的測定 參照吳均[16]的方法測定。將乳酸菌活化后以3%接種量接種到NaCl質量分數分別為0%、3%、5%、7%和9%的MRS液體培養基37 ℃培養,分別在0、2、4、6、12和24 h時取樣,測定各菌株的OD600 nm值。用未添加NaCl,接種量為3%的MRS液體培養基作為對照,以對應的NaCl濃度液體培養基調零。重復三次試驗取平均值。

1.2.4 模擬在人體胃腸道條件下的耐受性 對6株乳酸菌進行模擬人體胃腸道傳輸測試。模擬胃液參照Charteris等[17]的方法:將0.35 g胃蛋白酶用100 mL 0.2%的無菌生理鹽水稀釋混勻后,將溶液用鹽酸溶液調pH至2.5。模擬腸液參照Bao等[18]的方法:將0.1 g胰蛋白酶和1.8 g牛膽鹽加入到100 mL含1.1 g NaHCO3和0.2 g NaCl的蒸餾水中,混勻后用NaOH溶液將pH調至8.0。配制好的胃腸液用0.22 μm的膜采用膜過濾法進行消毒備用。將乳酸菌在MRS液體培養基中37 ℃培養24 h后,4000 r/min離心5 min,用pH7.0的PBS緩沖液沖洗3次,調整菌落數至108～109CFU/mL,并以10%的接種量轉接到模擬胃液中,采用平板計數法測定0和3 h的活菌數。以10%的接種量轉接到模擬腸液中測定0和4 h的活菌數并根據公式計算存活率。測定時間參考乳酸菌在人體胃腸道內的停留時間所確定。

存活率(%)=C1/C2×100

式中:C1為處理后的MRS液體培養基上所測得的乳酸菌活菌數(CFU/mL);C2為對照MRS液體培養基上所測得的乳酸菌活菌數(CFU/mL)。

1.2.5 乳酸菌抑菌活性的測定 參照曾小群等[19]用牛津杯法測定。在培養皿中倒入20 mL的LB瓊脂培養基,待冷卻凝固,將0.1 mL稀釋至106CFU/mL的指示菌菌懸液涂布于LB培養基上。在每個培養皿中放入4個牛津杯,在其中三個牛津杯中加入0.2 mL乳酸菌菌體濃度為109CFU/mL時離心得到的乳酸菌上清液,剩余牛津杯中加入等量MRS液體培養基作為對照,于37 ℃培養24 h,觀察抑菌圈并測量抑菌圈直徑大小。重復三次試驗取平均值。

1.3 數據分析

全部試驗數據采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0(SPSS Inc.,USA)數據處理系統進行分析,采用ANOVA進行方差分析,用Duncan’s法進行多重顯著性分析和標準偏差(±SE)計算,利用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 耐酸能力比較

強酸環境下可以抑制乳酸菌生長,甚至殺死菌體,乳酸菌到達腸道之前,必須先經過胃酸環境,因此,乳酸菌必須具有一定的耐酸能力,才能具有益生作用。根據飲食結構的不同,人體胃部的pH通常為3.0左右[8]。測定不同pH下各菌株生長24 h內液體培養基的OD值,比較乳酸菌菌株的耐酸性能,結果如圖1所示。

圖1 不同pH下菌株的OD值Fig.1 The OD value of tested strains in different pH注:同一pH下字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

由圖1可知,6株乳酸菌在培養周期內OD值均隨著培養基pH的降低而減小;同一菌株在不同pH時表現了不同的生長狀態,在低酸性條件下大量生長繁殖,高酸性條件下呈現緩慢繁殖能力或持平的態勢,表明不同菌株對酸的耐受能力不同。當培養基pH在2.5時,菌株G2、G4、Q1生長培養液的OD值隨著培養時間的增加呈增大的趨勢,說明菌株G2、G4、Q1在pH2.5條件下依舊能夠生長繁殖,對強酸具有較好的耐受性。菌株G1和G3在pH2.5時,在培養周期內,OD值緩慢增大但增幅較小,說明菌株具有一定的耐酸能力,但耐酸能力相對較弱。菌株Q2耐酸能力最弱,在pH2.5時,隨著培養時間增長,菌株生長培養液OD值基本保持不變,表明菌體處于低生存狀態,基本不生長繁殖,耐酸性能差。在pH3.5和4.5培養條件下,所有菌株的OD值都增大,說明各菌株對pH3.5存在一定的耐受性。在低pH條件下,菌體處于低生存狀態,可能是由于pH過低,導致乳酸菌無法維持自身細胞內pH的穩定,從而導致生長停滯,甚至衰亡[20]。綜上所述,所有乳酸菌菌株對不同的酸性條件有不同的耐受性,其中G2、G4、Q1對酸性環境的耐受性最好。

2.2 耐膽酸鹽能力的比較

乳酸菌耐受膽酸鹽的能力是其能在腸道中存活的必要條件,因此耐膽酸鹽能力是益生菌微生物的一個重要特征[10]。人體小腸中膽酸鹽濃度在0.03%～0.3%之間波動,能夠在正常生理膽酸鹽中生長和代謝的菌株才可能在腸道消化過程中存活[11]。乳酸菌菌株的耐膽酸鹽能力如圖2所示。

圖2 不同膽鹽濃度下菌株的OD值Fig.2 The OD values of tested strains in different bile salt concentration注:同一膽酸鹽濃度下字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

由圖2可知,6株乳酸菌在培養周期內OD值均隨著膽酸鹽濃度的增大而降低,不同菌株在同一濃度膽酸鹽條件下生長狀態不同,表明不同菌株對膽酸鹽的耐受能力不同。當膽酸鹽的添加量為0.1%和0.3%時,各菌株培養基的OD值升高,說明所有菌株對0.1%和0.3%的膽鹽具有一定的耐受性。當膽鹽濃度為0.5%時,菌株G2、G4的培養液OD值增大,其余菌株基本保持不變,說明菌株G2、G4對高濃度膽鹽具有一定的耐受性。不同乳酸菌菌株對膽酸鹽的耐受能力存在差異,可能是由于乳酸菌種屬差異及其長期所處的生存環境對菌株的影響所造成的[7]。綜上所述,所有乳酸菌菌株對不同的膽酸鹽濃度有不同的耐受性,其中,G2和G4的耐受性最強,G3的耐膽酸鹽的能力最弱。

2.3 耐滲透壓能力的比較

微生物能否在胃腸道中存活,滲透壓耐受性亦是關鍵評價指標之一。乳酸菌菌株的耐滲透壓能力如圖3所示。

由圖3可以看出,6株乳酸菌在培養周期內OD值均隨著NaCl濃度的增大而降低;不同菌株在相同濃度NaCl環境條件下生長狀態不同,表明不同菌株對NaCl的耐受能力不同。當培養液NaCl濃度為3%、5%、7%時,所有菌株培養液的OD值呈現增大的趨勢,說明各菌株對3%、5%和7%濃度的滲透壓具有一定的耐受性。當培養液NaCl濃度達到9%時,菌株G2、G4、Q1培養液的OD值均呈現增大的趨勢,說明菌株G2、G4、Q1在高濃度的滲透壓下依然能夠生長繁殖,具有較好的耐滲透壓的能力。其余菌株在9% NaCl濃度培養條件下培養液OD值基本保持不變,表明菌體處于低生存狀態,基本不生長繁殖,耐滲透壓能力差。因此,不同菌株對不同的滲透壓環境具有一定的耐受性,其中,菌株G2、G4、Q1的耐受性較強。有研究指出,乳酸菌能夠適應平穩的滲透壓變化,但滲透壓的突然增大或減小都抑制微生物的生長,甚至導致死亡[11]。

圖3 不同NaCl濃度下菌株的OD值Fig.3 The OD value of tested strains in different NaCl concentration注:同一濃度下字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 耐受模擬人體胃腸液能力

胃液的低pH環境和其中的胃蛋白酶對菌體的生長存在抑制作用。另外,小腸液中的各種酶和膽汁酸等也會對乳酸菌的生長產生抑制[7]。因此,胃腸道運輸測試是選擇潛在益生菌的重要標準。6株乳酸菌在模擬胃液和腸液下的生存能力見圖4和圖5。

圖4 菌株在模擬人體胃液條件下耐受性Fig.4 The viable counts(log CFU/mL)and survival rates of strains after 3 h in the simulated gastric juice

由圖4可以知,6株菌對模擬胃液的耐受性具有相似性又存在差異,在其中培養3 h后,活菌數較0 h差值均小于0.78 log CFU/mL,存活率均>90%。其中,菌株G2存活率最高為94%,活菌數較0h減少0.50 log CFU/mL。由圖5可以看出,所有乳酸菌菌株在模擬腸液下具有較高的存活率,在模擬腸液下生存4 h后的存活率高于模擬胃液下的存活率,存活率均在92%以上。其中,菌株G2和Q1的生存能力最強,存活率達到98%,菌株G4次之,存活率為97%。綜上所述,菌株G2、G4及Q1具有較好的耐受性。本研究中,所有菌株在模擬胃腸液環境下的存活率均在90%以上,活菌數減少量<0.78 log CFU/mL,這個結果高于De等[20]的研究結果;Prasad[21]對兩株商業發酵菌株的耐受能力進行了研究,其結果低于本研究的結果,活菌數減少了7.60 log CFU/mL,本研究與張蓓[7]的研究結果活菌數減少量<1.00 log CFU/mL相似。產生這種差異的原因可能歸因于乳酸菌來源的不同及乳酸菌種間差異所導致。

圖5 菌株在模擬人體腸液條件下耐受性Fig.5 The viable counts(log CFU/mL)and survival rates of strains after 4 h in the simulated intestinal juice

2.5 乳酸菌抑菌特性比較

6株乳酸菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌以及單增李斯特菌的抑菌能力如表1所示。由表1可以看出,本試驗的乳酸菌對不同致病菌的抑菌能力存在差異。通過比較乳酸菌對大腸桿菌的抑制效果,菌株Q2的抑菌效果最強,其抑菌圈直徑為(17.57±0.32) mm,菌株Q1的抑菌效果僅次于菌株Q2為(16.55±0.30) mm,抑菌能力最差為菌株G3,其抑菌圈直徑為(13.26±0.28) mm;比較乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制效果,菌株Q1和Q2的抑菌圈直徑分別達到(15.49±0.39)和(15.46±0.46) mm,抑菌效果較好,其次是菌株G2,其抑菌圈達到(14.87±0.10) mm;對沙門氏菌抑菌作用最強的為菌株Q2,抑菌圈直徑為(16.04±0.67) mm,抑菌能力最差為G3,抑菌圈直徑為(11.37±0.17) mm;對單增李斯特菌抑菌作用最強的為菌株G4,抑菌圈直徑為(16.66±0.31) mm。

表1 乳酸菌菌株的抑菌結果Table 1 Results on the antibacterial activity of LAB strains

不同乳酸菌的抑菌能力存在差異,研究表明革蘭氏陽性菌對乳酸桿菌更加敏感[22]。萬金敏[23]對傳統發酵牦牛乳中的5株乳酸菌研究發現,其抑菌圈最大直徑在15.24～18.21 mm之間變化,與本文的研究結果較一致。而吳均[16]對耐久腸球菌抑菌性能研究發現,其抑菌圈在9.50～12.70 mm的范圍內,低于本研究的結果。另外,乳酸桿菌與乳酸球菌的抑菌性能存在一定差異,張蓓[7]對曲拉中乳酸桿菌研究發現,所有菌株對大腸桿菌的抑菌性較差,這與本文的研究結果存在差異,可能原因是菌株種間的差異所導致。總體來看,在本研究中的6株菌既能抑制G+菌,又能抑制G-菌,說明它們具有相對較寬的抑菌譜。

3 結論

菌株耐受性試驗結果表明,6株乳酸菌菌株的耐酸能力、耐膽鹽能力和耐滲透壓能力各不相同,其中菌株G2、G4、Q1對酸性環境的耐受性最好,G2和G4的耐膽酸鹽的能力最強,G2、G4、Q1對高滲透壓的耐受性較強,所有菌株在模擬胃腸液環境下的存活率均在90%以上;菌株抑菌試驗結果表明,6株乳酸菌菌株的抑菌性能各不相同,其中菌株Q2對大腸桿菌的抑菌效果最強,菌株Q1次之;菌株Q1和Q2對金黃色葡萄球菌的抑制效果較好,其次是菌株G2;對沙門氏菌抑菌作用最強的為菌株Q2,最差的為G3;對單增李斯特氏菌抑菌作用最強的為菌株G4。

綜合比較,菌株G2、G4、Q1耐受能力及抑菌能力較為突出,具有開發利用價值。