毛細管電泳色譜聯用法(CECLIF)檢測運動營養品中α2受體激動劑

郭 翔

(重慶人文科技學院,重慶 401524)

運動營養品是針對運動人群開發的一類補充蛋白質、維生素等營養元素的食品,在近些年開始越來越流行,其中以補充蛋白質類在運動營養品較多[1]。而蛋白質補充劑多數以人工飼養畜禽類的動物源性原料制成,然而此類畜禽在飼養過程中易受到β-受體激動劑濫用的影響[2-3],造成最終產品中此類受體激動劑的超標。因此我國加大了對明令禁止的15種β-受體激動劑非法使用的打擊力度,然而具有促進動物生長、提高瘦肉率功效,而未被列入國家禁用藥物名單的β-受體激動劑同系物或衍生物,如α2-受體激動劑(可樂定、賽庚啶、賽拉嗪、右美托咪啶、胍那芐等),此類受體激動劑在動物促生長方面也有明顯的效果,可顯著提高豬的瘦肉率,降低了脂肪比率和背膘厚[4-5]。然而我國針對α2-受體激動劑類藥物發布相關標準不多[6-7],仍然缺乏對多種α2-受體激動劑類藥物檢測的方法標準。因此建立以含動物源性蛋白為基質的食品中α2-受體激動劑的檢測方法十分必要,特別是對運動員這類特殊人群的運動營養品中受體激動劑的篩查檢測,評價此類食品的安全具有重要意義。

目前國內外檢測α2-受體激動劑的方法主要有毛細管電泳法(Capillary electrophoresis,CE)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、高效液相色譜-質譜聯用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)、毛細管電泳-色譜聯用法(Capillary Electrophoresis Chromatography-Excited Induced Fluorescence,CEC-LIF)等[8-12]。毛細管電泳法由于方法的局限性,檢測靈敏度一般不高[13];而高效液相色譜法、液相色譜質譜聯用法雖然方法的靈敏度能達到,但是樣品的前處理復雜,步驟繁瑣,限制了其實際的使用范圍[14-15];而CEC-LIF,兼具了高效液相色譜法和毛細管電泳法的雙重分離機制,并結合運用了靈敏度與選擇性極強的激光誘導熒光技術,檢測的靈敏度可以達到納克級別,可以檢測多種微量的α2-受體激動劑[16-18]。CEC-LIF結合激光誘導熒光技術的研究國內外也有報道,Nguyen等[19]采用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱(4-fluoro-7-nitrobenzofurazan,NBD-F)熒光衍生結合毛細管區帶電泳聯用技術,快速靈敏地分離檢測了食品中的精胺和組胺;雷霄云等[20]采用毛細管電色譜-激發誘導熒光檢測動物性食品中多肽類抗生素,所建立方法的靈敏度能滿足對多肽類獸藥的殘留檢測要求;Sapan等[21]以NBD-F為柱前衍生試劑,結合HPLC-熒光檢測(FD)分析了大鼠血漿中的氨基酸,檢出限可達2.8～20 fmol。但是針對運動營養品這類基質較復雜的樣品,前處理的過程、衍生條件的控制以及儀器參數的選擇等都會對α2-受體激動劑的測定結果產生很大的影響。所以本實驗在參考相關文獻的基礎上[19-23],優化相關實驗條件,建立一種毛細管電泳-色譜聯用測定運動營養品中α2-受體激動劑的方法,以滿足我國市場上對此類檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α2-受體激動劑標準品(賽拉嗪99.6%、右美托咪啶99.3%、胍那芐98.5%) 上海安譜公司產品;硼酸(分析純) 中國化學試劑研究所;乙腈和乙醇(色譜純) 上海國藥集團化學試劑有限公司;衍生試劑NBD-F純度97% 日本東京化成工業株式會社;樣品 隨機購買于超市的動物源性運動營養品。

Risep-610型毛細管電泳-色譜分析系統 賽默飛世爾公司;2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;4100型激發誘導熒光檢測器 中科院大連物化研究所;KQ-500數控超聲波儀 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 實驗稱取2.00 g樣品于20 mL離心管中,分別加入5 mL乙酸鉛(20 mg/L)以及5 mL三氯乙酸(20 mg/L)進行超聲(功率500 W,40 kHz)提取30 min,4000 r/min離心15 min后移取上清液;將上清液加入到Oasis HLB固相萃取柱,分別用6 mL甲醇和水依次活化后上樣,首先棄去流出液,然后用6 mL水洗滌,棄去流出液,用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液并于40 ℃氮氣吹干。殘余樣品用1.0 mL流動相溶解混勻,用0.22 μm有機濾膜過濾,再進行熒光衍生反應并毛細管電泳-色譜檢測。

1.2.2 熒光衍生反應條件的優化 取濃度為5 μg/mL的賽拉嗪、右美托咪啶和胍那芐的α2-受體激動劑物質混合溶液200 μL,加入200 μL硼酸溶液(50 mmol/L)、200 μL乙醇后,再加入200 μL NBD-F溶液,避光進行衍生反應。分別研究衍生劑濃度、衍生反應pH、衍生反應時間以及衍生反應溫度對衍生反應的影響,以3種目標物的平均回收率作為判定指標。激光誘導熒光檢測器參數為分離電壓:-10 kV、輔助壓力:3.8 MPa、檢測波長:λex/λem=473 nm/530 nm。

1.2.2.1 衍生劑濃度的選擇 在對3種α2-受體激動劑進行衍生反應時,需要加入適量的NBD-F來保證目標物質的完全反應,使衍生效率達到最大,但過量的NBD-F試劑將增大背景干擾,導致分離效率降低,無法準確定量。本實驗在衍生反應pH7.2、衍生反應時間20 min、衍生反應溫度40 ℃的條件下,分別考察NBD-F濃度在0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol/L時,對3種α2-受體激動劑平均回收率的影響。

1.2.2.2 衍生反應pH的選擇 賽拉嗪、右美托咪啶以及胍那芐的衍生化氨基反應一般是在堿性條件下進行的,本實驗在衍生劑NBD-F濃度1.0 mmol/L、衍生反應時間20 min、衍生反應溫度40 ℃的條件下,分別考察衍生反應pH在6.6、7.2、7.8、8.3、8.9、9.5、10.1、10.7時,對3種α2-受體激動劑平均回收率的影響。

1.2.2.3 衍生反應時間的選擇 衍生反應的時間會對衍生反應的反應程度以及衍生物的量產生影響,本實驗在衍生劑NBD-F濃度1.0 mmol/L、衍生反應pH8.9、衍生反應溫度40 ℃的條件下,分別考察衍生反應時間在5、10、15、20、25、30、35、40 min時,對3種α2-受體激動劑平均回收率的影響。

1.2.2.4 衍生反應溫度的選擇 賽拉嗪、右美托咪啶以及胍那芐在高溫下不穩定,為了保證目標物的穩定性,實驗在衍生劑NBD-F濃度1.0 mmol/L、衍生反應pH8.9、衍生反應時間30 min的條件下,考察衍生反應溫度在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃時,對3種α2-受體激動劑平均回收率的影響。

1.2.3 色譜條件的優化 色譜條件:色譜柱選擇苯基毛細管電色譜填充柱(50 μm×55 cm,3 μm);流速:0.03 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。3種α2-受體激動劑的色譜分離選用乙腈-磷酸鉀緩沖液流動相體系,分別考察磷酸鉀緩沖液的濃度以及乙腈的比例對3種目標物衍生物分離的影響。

1.2.3.1 流動相中磷酸鉀濃度的選擇 在毛細管電泳色譜分離過程中,流動相的主要驅動力來自壓力流、電泳力或電滲流,而流動相的黏度影響電泳遷移率和電滲流的大小,所以本實驗固定流動相乙腈-磷酸鉀緩沖液(55∶45,v/v)的比例,分別考察磷酸鉀濃度為5、10、15、20 mmol/L時,3種α2-受體激動劑衍生物在色譜圖上的分離效果。

1.2.3.2 流動相中乙腈比例的選擇 在乙腈-磷酸鉀緩沖液流動相體系中,乙腈比例的大小影響著流動相的極性,同時也影響目標物的色譜保留行為。本實驗固定流動相中磷酸鉀濃度為10 mmol/L,分別考察乙腈比例為50%、55%、58%、60%時,3種α2-受體激動劑衍生物在色譜圖上的分離效果。

1.2.4 方法學驗證 配制一系列不同質量濃度的α2-受體激動劑混合標準溶液(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL),在優化好的熒光衍生和色譜條件下,進行標準曲線的制作、穩定性與重復性實驗和加標回收實驗。

2 結果與討論

2.1 熒光衍生反應條件的優化

賽拉嗪、右美托咪啶以及胍那芐的化學結構中沒有熒光發色基團,且紫外吸收弱,需要通過NBD-F衍生后才有熒光反應,衍生原理見圖1。

圖1 NBD-F衍生含氨基化合物的原理圖Fig.1 Schematic diagram of derivatization for aminocontaining compounds with NBD-F

衍生反應中,3種α2-受體激動劑與NBD-F的反應程度會影響到待測目標物被檢出的量,所以衍生劑濃度、衍生反應pH、衍生反應的時間和溫度都對其有影響,本實驗要對其進行優化,以達到最優的目標回收率。

2.1.1 衍生劑濃度的選擇 由圖2可知,在0.1～1.0 mmol/L范圍內,隨著衍生試劑濃度的增加,3種α2-受體激動劑的檢測回收率的逐漸提高,說明衍生反應也越完全,并在1.0 mmol/L時回收率達到最大值,表明衍生反應基本完全;繼續增大衍生劑的濃度,將導致衍生試劑和水解產物殘留,熒光效率不再增加[18]。因此選擇1.0 mmol/L的衍生試劑濃度進行下一步實驗。

圖2 衍生劑濃度對α2-受體激動劑平均回收率的影響(n=5)Fig.2 Effect of derivatives concentration on average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.1.2 衍生反應pH的選擇 由圖3可知,衍生反應體系溶液的pH在6.6～10.7范圍內,隨著pH的增大,反應體系的堿性增強,增加了衍生試劑與α2-受體激動劑的反應的概率,熒光響應有顯著提高,當pH為8.9時達到最大;繼續增大pH,此時目標物不穩定易分解,造成衍生效率下降,副產物增多[19],因此將反應體系溶液的pH設為8.9。

2.1.3 衍生反應時間的選擇 由圖4可知,適當延長衍生反應時間有助于熒光衍生效率的提高。當衍生反應在5～30 min范圍內,隨著衍生反應時間的延長,衍生產物的回收率不斷提高;當衍生反應提高到30 min時,3種α2-受體激動劑的衍生產物回收率達到最大值,繼續延長衍生反應時間容易使衍生試劑水解產物增多,干擾分析[20]。因此將衍生反應時間設為30 min。

圖4 衍生反應時間對α2-受體激動劑平均回收率的影響(n=5)Fig.4 Effect of derivative reaction time on average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.1.4 衍生反應溫度的選擇 由圖5可知,當溫度較低時,衍生劑與受體激動劑的反應概率較小,熒光衍生效率較低,隨著反應溫度逐漸加大,衍生效率逐漸增加,60 ℃時,產物的熒光效率達到最大;再增大反應溫度會增加熒光分子與溶劑分子相互碰撞淬滅的概率,使熒光量子產率變小,而且溫度過高會產生更多的副產物,干擾對目標物的分離分析[20]。因此最終將衍生反應溫度設為60 ℃。

圖5 衍生反應溫度對α2-受體激動劑平均回收率的影響(n=5)Fig.5 Effect of derivative reaction temperature on the average recovery rate of α2-receptor agonists(n=5)

2.2 色譜條件的優化選擇

2.2.1 流動相中磷酸鉀濃度選擇 結果如圖6所示,隨著磷酸鉀緩沖液濃度的增大,流動相黏度逐漸變大,擴散系數逐漸變小,使得雙電層厚度減小,管壁的Zeta電勢也逐漸減小,導致電滲流變小,目標物分析時間延長。其中,右美托咪啶和胍那芐熒光衍生產物色譜峰的保留時間增加趨勢較明顯,這可能是由于在pH5.0時這兩種物質帶負電荷,電泳方向與電滲流方向相反;賽拉嗪的熒光衍生產物此時更趨向于中性分子,所以色譜峰保留時間主要受電滲流影響,變化略小[17,21]。綜合考慮分析物的保留時間、分離度和峰形,實驗選擇10 mmol/L磷酸鉀鹽溶液作為流動相緩沖液。

圖6 緩沖液濃度對α2-受體激動劑色譜分離的影響Fig.6 Effect of buffer concentration on chromatographic separation of α2-receptor agonists注:峰1和峰2為賽拉嗪;峰3和峰4為右美托咪啶;峰5和峰6為胍那芐;NBD-OH:4-氟-7-羥基-2,1,3-苯并惡二唑;圖7同。

2.2.2 流動相中乙腈比例的選擇 結果如圖7所示,隨著乙腈比例的增加,目標物在色譜柱上的保留時間減少,這是由于乙腈比例的增加使得流動相的黏度減小,Zeta電位和電滲流變大,降低了目標物在苯基反相柱上的保留[21]。當乙腈的體積分數超過55%時,雖然分析物的響應值有明顯的增大,但是分離度卻有所降低[22]。綜合考慮,將流動相中乙腈的體積分數設為55%。

圖7 乙腈比例對α2-受體激動劑分離的影響Fig.7 Effect of ACN ratio on the separation of α2-receptor agonists

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線的制作 實驗結果表明,3種目標組分在1.0～20.0 ng/mL內均具有良好的線性關系(R2>0.99),并得到3種目標組分的LOD均為5.0 μg/kg,LOQ均為16.0 μg/kg,結果見表1。

表1 3種α2-受體激動劑的標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 1 Standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of three α2-receptor agonists

現有α2-受體激動劑分析方法可以參考飼料中可樂定和賽庚啶的測定的標準方法[5-6],采用UPLC-MS/MS法,其使用成本與操作要求均較高,檢出限為50 μg/kg。本方法無需梯度洗脫,衍生快速高效,檢出限更低,而且可以避免大量非熒光雜質的干擾,對于運動營養品食品中α2-受體激動劑類物質的檢測具有適用性。

2.3.2 穩定性與重復性 在最優條件下,對20.0 ng/mL的3種α2-受體激動劑物質混合標準溶液進行熒光衍生和CEC-LIF檢測分析,連續測定7 d,每天進樣3次,測得3種目標物保留時間的日間和日內相對標準偏差(RSD)分別為3.5%～8.6%和3.1%～3.7%;峰面積的日間和日內RSD分別為3.3%～7.5%和2.6%～2.9%。說明該方法的穩定性和重復性均良好,可用于3種α2-受體激動劑物質的分析研究。

2.4 加標回收實驗

利用空白基質的樣品進行加標回收率實驗,測定結果見表2。

表2 方法的回收率及相對標準偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of the method(n=5)

由表2可見,3種α2-受體激動劑的加標回收率為80.5%～93.4%,RSD為2.4%～7.1%,表明本實驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

3 結論

本文建立了一種毛細管電色譜與激光誘導熒光聯用檢測運動營養品中賽拉嗪、右美托咪啶、胍那芐等3種α2-受體激動劑的分析方法。衍生反應選擇NBD-F濃度為1.0 mmol/L、衍生反應pH為8.9、衍生反應時間為30 min以及衍生反應溫度為60 ℃的條件下,以乙腈-磷酸鉀(10 mmol/L)(55∶45,v/v)為流動相,經苯基毛細管色譜填充柱進行分離,3種α2-受體激動劑能在1.0～20.0 ng/mL內均具有良好的線性關系,3種組分的LOD均為5.0 μg/kg,LOQ均為16.0 μg/kg。樣品中3種α2-受體激動劑的加標回收率為80.5%～93.4%,相對標準偏差為2.4%～7.1%,所建立的方法有效解決了測定這類α2-受體激動劑樣品時樣品前處理復雜、回收率低的分析難點,可為運動營養品中α2-受體激動劑的分析和監控提供技術支持。