RecQ5表達與骨肉瘤組織惡性程度間的關系分析

支力強，同志超，姚舒馨，卿忠，李萌，馬建兵

(1.西安市紅會醫院關節外科，陜西 西安 710054；2.西安市紅會醫院骨病腫瘤科，陜西 西安 710054；3.西安交通大學第一附屬醫院骨科，陜西 西安 710061)

骨肉瘤是一種多發于兒童和青少年的原發性惡性骨腫瘤，其特點為惡性程度高、肺轉移率高和易復發。手術切除和輔助化療等治療方法雖使骨肉瘤患者的生存期有所延長，生活質量有所提高，但其預后仍無明顯改善。最近研究顯示，DNA損傷會導致基因的不穩定性而誘發細胞發生惡性轉化甚至死亡[1-3]。RecQ解旋酶家族被證實參與DNA復制、修復(包括錯配修復、堿基切除修復和直接修復)、損傷檢測和端粒維護等眾多生物學過程，在維持基因穩定性上發揮著重要作用[4-5]。人類RecQ解旋酶家族成員包括：RecQ1、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5。目前多數研究僅僅局限于BLM、WRN和RecQ4這3個基因上，但對于RecQ5基因與腫瘤尤其是骨肉瘤的關系則研究較少，本文擬通過測量RecQ5在骨肉瘤組織不同惡性程度及不同細胞株間的表達，探討RecQ5表達與骨肉瘤組織惡性程度間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本實驗所選病例系西安市紅會醫院和西安交通大學第一附屬醫院2015年1月至2017年12月中手術切除的35例骨肉瘤標本和存檔中石蠟包埋骨肉瘤標本、骨肉瘤癌旁組織標本20例及正常骨組織標本20例，其中骨肉瘤標本中男20例，女15例；年齡9～56歲，平均(20.3±4.2)歲。納入標準：經臨床、影像學及病理學三者相結合確診骨肉瘤者，術前均未行放療。排除標準：排除Paget's病、骨纖維結構不良等影響骨結構病變，并排除其他腫瘤轉移病史。正常骨組織取自于全髖關節置換術和股骨頭置換術患者的骨組織。

1.2 實驗方法 由兩名病理科醫生獨立對染色結果進行判斷評分。以2011年第7版中美國癌癥聯合會(American joint committee on cancer，AJCC)對于骨肉瘤分期系統法為標準對骨肉瘤進行分期評判。

通過SP免疫組化法檢測不同組織中RecQ5的表達情況。RecQ5在不同組織中的表達判定標準：以胞核和/或胞漿中出現RecQ5蛋白棕黃色染色為陽性。陽性細胞的百分比為200倍鏡下5個視野內的陽性細胞平均數，0分：<10%；1分：11%～25%；2分：26%～50%；3分：>51%；表達強度以著色程度為標準進行計分：未著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相加為其最后得分：0～1分評定為陰性(-)；2～4分弱陽性(+)；4～5分中陽性(++)；大于6分為強陽性(+++)；以PBS代替一抗作為陰性對照。培養人骨肉瘤細胞株hFOB1.19、U2OS和人成骨細胞株MG-63，通過Real-time PCR和Western blot法檢測不同細胞株間RecQ5的表達程度。

2 結 果

2.1 RecQ5在不同組織中的表達 本研究采用第7版AJCC分期中關于骨與軟組織肉瘤分期系統作為骨肉瘤標本的分期標準，分別選取了骨肉瘤StageⅠ、Ⅱ、Ⅲ期中的部分標本，因Stage Ⅳ期與腫瘤大小無關，故未選取StageⅣ的標本。鏡下觀察RecQ5的陽性染色主要為細胞核和/或胞質出現的棕黃色顆粒(見圖1)。

a 正常骨組織 b 骨肉瘤癌旁組織 c 骨肉瘤組織

d 正常骨組織虛線所框區域的局部放大圖 e 骨肉瘤癌旁組織虛線所框區域的局部放大圖 f 骨肉瘤組織虛線所框區域的局部放大圖

注：RecQ5陽性染色表現為細胞核或細胞質內出現棕黃色的顆粒

圖1 不同組織中RecQ5的表達情況(SP免疫組化法，×200)

通過初步分析RecQ5表達的陽性率發現，在正常骨組織中，RecQ5的表達陽性率為100%(20/20)，在癌旁組織中的表達陽性率為90%(18/20)，而在骨肉瘤組織中，RecQ5表達陽性率為68.5%(24/35)。其中，正常骨組織、癌旁組織與骨肉瘤組織RecQ5表達陽性率之間差異有統計學意義(P=0.008)，但正常骨組織與癌旁組織之間的陽性率差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。為了進一步分析其表達強度與組織惡性程度之間的關系，我們選取正常骨組織、癌旁組織及不同分期的骨肉瘤組織進行染色發現，RecQ5的表達強度隨著組織惡性程度的不斷增加而逐漸減弱，差異有統計學意義(P<0.05)。且在骨肉瘤組織中，隨著腫瘤分期增加其表達強度也逐漸減弱，差異有統計學意義(P<0.05)，即RecQ5表達的強弱與組織的惡性程度呈負相關(見表2，見圖2)。

表1 RecQ5表達的陽性率與不同組織間的關系

表2 RecQ5表達強度與腫瘤分期之間的關系

a stage I b stage Ⅱ c stage Ⅲ

圖2 不同骨肉瘤AJCC分期中RecQ5的表達情況(SP免疫組化法，×200)

2.2 RecQ5在不同細胞株中的表達 我們檢測了RecQ5在人骨肉瘤細胞株MG-63、U2OS和人成骨細胞株hFOB1.19中的表達情況。Real-time PCR及Western blot結果顯示，RecQ5在3株細胞中均可穩定表達，但在MG-63和U2OS細胞mRNA及蛋白水平上的表達情況均較hFOB1.19細胞低(P<0.05，見圖3)，且在MG-63細胞上的表達略低于U2OS細胞。

3 討 論

RecQ5作為RecQ解旋酶家族的一員，在DNA復制、重組和修復過程中都有著重要作用[6]。與其他RecQ解旋酶只在部分特定組織中表達有所不同的是，RecQ5在人體組織中都存在一定的表達，而目前研究主要集中于WRN、BLM基因上，對RecQ5表達程度與腫瘤之間關系的研究尚少，而在骨肉瘤中的表達情況更少[7]。Lao等[8]研究RecQ家族基因在大腸癌上的表達情況時發現，BLM和RecQ4在大腸癌組織的mRNA水平上的表達程度高于正常組織，而RecQ1、WRN和RecQ5的表達則低于正常組織。且在免疫組化實驗中也出現了類似mRNA水平的變化趨勢，但未發現這些基因的表達程度與腫瘤分期之間存在相關性。在隨后的細胞實驗中發現，BLM和RecQ1在mRNA和蛋白水平的表達顯著低于正常細胞，RecQ4的表達明顯高于正常細胞，其余成員在mRNA水平與正常細胞相比未見明顯差異。WRN和RecQ5在蛋白水平的表達程度與mRNA并不一致，其表達強度明顯低于正常組織，推斷這可能是由于正常組織中RecQ5的啟動子并未甲基化，而腫瘤組織中則存在大量異常的RecQ5啟動子甲基化所導致的。綜合這些蛋白已知的功能可以明確，RecQ5在大腸癌的發生過程中起著抑制的作用，但其具體機制仍未明確。而Arora等[9]在乳腺癌最常見的3種細胞株MM-436、MCF-7及MM-231上發現RecQ5在mRNA水平的表達程度高于在正常乳腺上皮細胞MCF10A。在隨后研究中還發現，RecQ5 mRNA的高表達與乳腺癌的病理特征存在密切聯系，包括較差的腫瘤分化程度、表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)高表達和三陰性表型的乳腺癌，且其較高的mRNA水平還可明顯影響患者的生存時間。因此，其認為RecQ5的mRNA水平不僅可以作為評價乳腺癌細胞增殖能力的指標，而且可以作為判斷乳腺癌患者預后的一個獨立的影響因素。但其在蛋白水平的檢測中出現了與mRNA水平相反的結果，較低的RecQ5蛋白表達水平對應的是腫瘤較差的分化程度等，且并沒有顯著影響患者的生存時間。故其分析RecQ5可能還受控于一種復雜的轉錄后調節，具體機制尚不清楚，又或者是因為其表達水平存在一種“閾效應”，而這個閾值暫時無法用mRNA的表達水平來準確測量。

圖3 Real-time PCR及Western blot檢測RecQ5在不同細胞中的表達情況

在本組的前期研究中，我們發現RecQ5在骨肉瘤與正常骨組織上的表達也存在明顯差異，其在骨肉瘤上的表達程度明顯低于正常組織。其后又根據Enneking分期法對其表達程度與腫瘤惡性程度進行進一步分析后發現，不同分期的腫瘤組織中RecQ5表達程度也存在著差異，其表達程度與Enneking分期呈負相關[10]。本實驗在前期研究的基礎上，首次采用新的AJCC分期系統對骨肉瘤進行分級和分期。與以往的Enneking分期系統相比，可更準確地判斷出腫瘤的病理學分級和腫瘤分期，從而更早地確定下一步的治療方案。本實驗通過檢測RecQ5在骨肉瘤組織、癌旁組織及正常骨組織這3種不同惡性程度樣本的表達后發現，RecQ5的表達陽性率在不同惡性程度的組織中存在差異，在正常組織和癌旁組織中RecQ5的表達陽性率都與骨肉瘤組織之間存在顯著差異，但在正常組織與癌旁組織之間則未見明顯差異，出現這種現象考慮可能是由于本實驗的癌旁組織絕大多數取材自距腫瘤邊緣3cm以上的部位，而這些“癌旁組織”在行腫瘤切除術時即可認為是手術切除的安全區域[11-14]，可基本等同于正常組織，故與正常組織未見明顯差異，但也不能排除因癌旁組織樣本量較小導致的差異無統計學意義，可在以后的實驗中加大樣本量再次驗證以上結果。隨后我們在分析其表達強度與骨肉瘤分期之間的關系時發現，隨著腫瘤分期的增加，RecQ5的表達程度逐漸減弱，出現了RecQ5的表達強度隨著腫瘤惡性程度增加而逐漸減弱的趨勢，即RecQ5的表達程度與骨肉瘤分期呈負相關。這與我們前期研究的結果一致，也與Yiduo等[15-16]的研究結果相似。在隨后的細胞實驗中，我們利用可以定量分析的Real-time PCR檢測RecQ5在不同骨肉瘤細胞株及正常成骨細胞中的表達量，結果顯示RecQ5在U2OS和MG-63細胞株mRNA和蛋白水平上的表達程度明顯低于hFOB1.19細胞，與免疫組化的趨勢相符，也與我們前期實驗結果一致。參考以往研究結果可推測RecQ5能夠維持細胞基因組的穩定性，其缺失會使細胞在復制過程中的錯誤不能及時糾正，故使復制錯誤得以不斷累積，繼而導致正常細胞功能的改變，使基因組損傷的細胞發生惡性轉化。但是，到底是RecQ5的缺失導致骨肉瘤的發生還是骨肉瘤發生后導致RecQ5表達的下降或缺失我們不得而知，為了進一步證實兩者間的關系，我們在以后的實驗中將繼續進行研究。