低氧誘導(dǎo)因子和脯氨酸羥化酶在骨發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)中的作用

夏玉城，陶樹清

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

低氧發(fā)生在骨骼發(fā)育的幾個(gè)階段。骨骼細(xì)胞通過低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(hypoxia inducible factors，HIF)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)并促進(jìn)糖酵解，增加氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送及代謝適應(yīng)，以防止骨化中心內(nèi)軟骨細(xì)胞死亡，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨作用。然而，在骨骼發(fā)育過程中必須避免過高的HIF水平，因?yàn)橛纱藢?dǎo)致的代謝失調(diào)會使骨骼發(fā)育不良。最近的研究表明，HIF還以其他基因?yàn)榘悬c(diǎn)增加骨量：它通過增加骨保護(hù)素(osteoprotegrin，OPG)表達(dá)來減少破骨過程，通過抑制表觀遺傳骨硬化蛋白表達(dá)，使骨形成增加，骨吸收減少。此外，骨膜細(xì)胞中HIF信號的增加可促進(jìn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的生長，并誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)的產(chǎn)生，導(dǎo)致紅細(xì)胞增多癥。最后，HIF通過EPO直接或間接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor23，F(xiàn)GF23)的表達(dá)和加工，從而影響維生素D代謝和骨穩(wěn)態(tài)。因此，骨骼細(xì)胞中的HIF信號不僅影響它們的行為，還能影響紅細(xì)胞生成和骨穩(wěn)態(tài)。

1 介 紹

在整個(gè)生命過程中，骨通過成骨細(xì)胞的骨生成和破骨細(xì)胞的骨吸收作用不斷重塑，以維持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性[1-2]。骨骼細(xì)胞的功能不僅受激素、生長因子、神經(jīng)系統(tǒng)信號和機(jī)械刺激的調(diào)控，還受局部微環(huán)境影響。氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)對于正常的骨細(xì)胞功能來說非常重要，這一點(diǎn)已經(jīng)得到廣泛證實(shí)。雖然骨骼是一個(gè)高度血管化的器官[3]，但骨微環(huán)境的特定區(qū)域氧含量卻很低[4]，這可能是由于毛細(xì)血管系統(tǒng)的組織血流量低以及造血骨髓細(xì)胞需氧量高導(dǎo)致的[5]。骨骼細(xì)胞通過感知低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(hypoxia inducible factors，HIF)的水平，從而對局部含氧量波動作出反應(yīng)。HIF是細(xì)胞對低氧的反應(yīng)，而脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)以氧依賴的方式調(diào)整HIF的水平。

轉(zhuǎn)錄因子HIF-1、HIF-2和HIF-3是低氧反應(yīng)的中心介質(zhì)，是由氧敏感的HIF-α亞基和結(jié)構(gòu)性表達(dá)HIF-β組成的異二聚體亞單位[6-7]。在常氧環(huán)境中，HIF-α的半衰期小于5min，這種快速的常氧循環(huán)是以氧、二價(jià)鐵和α酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)為底物，通過PHD使需氧區(qū)域內(nèi)特定殘基的羥基化，從而降解HIF的過程。已發(fā)現(xiàn)至少有三種PHD亞型(PHD1、PHD2和PHD3)羥基化HIF-α，它們是依賴α-KG的需氧雙加氧酶家族的一種。羥基化促進(jìn)HIF-α的泛素化，也是與腫瘤抑制蛋白(protein von hippel-lindau，pVHL)結(jié)合的關(guān)鍵，pVHL是E3泛素連接酶復(fù)合物的識別成分，以HIF-α為靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白水解降解。隨著氧水平的降低，PHD羥基化的作用減弱，從而使HIF-α更加穩(wěn)定[6-7]。這時(shí)HIF-α進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-β形成二聚體，并且在與轉(zhuǎn)錄共激活因子(如CBP/p300)結(jié)合后，進(jìn)一步結(jié)合低氧反應(yīng)基因啟動子區(qū)域內(nèi)的低氧反應(yīng)元件(hypoxic response elements，HRE)。HIF信號的激活影響多種細(xì)胞和組織功能，但其主要是通過刺激血管生成來恢復(fù)降低的氧含量，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝使細(xì)胞在低氧損傷中存活。

所有的骨骼細(xì)胞類型，包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，都表達(dá)了低氧信號通路的主要成分，而且越來越多的證據(jù)表明，在骨發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)過程中調(diào)節(jié)低氧信號通路的重要性。

2 骨發(fā)育過程中的低氧、HIF和PHD

胚胎骨骼發(fā)育始于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的聚集。雖然顱骨的扁平骨是由直接分化為成骨細(xì)胞(即膜內(nèi)成骨)的MSCs發(fā)育而來，但其他骨則是由骨組織替代軟骨而來[1-2]，后一過程稱為軟骨內(nèi)成骨，已有多項(xiàng)研究表明，低氧信號通路是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[8]。

2.1 HIF控制早期骨發(fā)育 通過軟骨內(nèi)成骨形成長骨是在多能MSCs聚集形成軟骨細(xì)胞之前開始的[9]。在這些初始階段，肢體血管系統(tǒng)經(jīng)歷了一個(gè)重塑過程，使聚集的MSCs缺乏血管，從而導(dǎo)致了低氧[10]。

肢體骨發(fā)育過程中，表達(dá)同源盒基因1(paired-related homeobox gene 1，Prx1)的細(xì)胞中HIF-1α的缺失不影響MSCs聚集，但延遲了MSCs分化為軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的終末分化[10]。潛在的機(jī)制尚不完全清楚，但可能涉及HIF依賴的人體性別決定相關(guān)的高移動編碼框基因9(SRY-related high mobility group-box gene9，SOX9)的調(diào)節(jié)，SOX9基因是肢體骨發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子[10]。與HIF-1α相比，在缺乏HIF-2α的小鼠肢體骨中，只觀察到骨骼發(fā)育的短暫延遲[11-12]。通過條件失活pVHL，進(jìn)一步研究了與HIF-1α和HIF-2α的積累和低氧信號通路在肢體發(fā)育過程中的作用。表達(dá)Prx 1的肢體骨細(xì)胞中pVHL的缺失不影響MSCs向軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，卻影響軟骨細(xì)胞的增殖、存活和終末分化，從而導(dǎo)致肢體縮短[13]。潛在的分子機(jī)制以及HIF氧傳感器在這一過程中的作用仍然不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，HIF-1α緊密調(diào)控早期肢體骨發(fā)育，包括MSCs的存活與軟骨細(xì)胞的增殖和分化。

2.2 HIF與PHD的相互作用決定了軟骨細(xì)胞在骨化中心的功能 MSCs聚集后，中央?yún)^(qū)域的MSCs分化為軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞開始增殖，形成軟骨模板，為將來的成骨做準(zhǔn)備。隨后，中心區(qū)域的軟骨細(xì)胞停止增殖，變得肥大，并與周圍的骨母細(xì)胞共同產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，刺激血管向內(nèi)生長[9]。成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，Osx)陽性骨母細(xì)胞與侵入血管一起進(jìn)入軟骨模板的過程[14]，標(biāo)志著初級骨化中心(primary ossification center，POC)發(fā)育的開始。低氧應(yīng)激是否參與POC的形成，目前尚缺乏研究。另一方面，肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)可以穩(wěn)定HIF-1α，從而以不依賴低氧的方式驅(qū)動血管向內(nèi)生長[15]。

POC的形成，限制了軟骨細(xì)胞在長骨兩端的生長。在骨化中心內(nèi)細(xì)胞向縱軸方向發(fā)展，增殖的軟骨細(xì)胞位于骨末端，肥大的軟骨細(xì)胞位于骨干處。隨著胎兒骨化中心在無血管情況下的擴(kuò)張，中心缺氧更加嚴(yán)重，因此HIF-1α是軟骨細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)控因子[16]。事實(shí)上，表達(dá)Ⅱ型膠原(collagen type 2，COL2)的軟骨細(xì)胞中HIF-1α的條件性缺失可導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞死亡，這在中心區(qū)域更加顯著[16]。由于骨化中心內(nèi)缺乏血管，低氧激活軟骨細(xì)胞中的HIF通路，通過誘導(dǎo)血管生成改善氧和營養(yǎng)供應(yīng)。表達(dá)于增生和肥大軟骨細(xì)胞內(nèi)的VEGF，是最有效的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原[17-18]，同時(shí)也是HIF的直接靶向基因[19]。在小鼠軟骨細(xì)胞中條件性缺失VEGF或聯(lián)合缺失VEGF120和VEGF164導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20-21]。然而，上述細(xì)胞的死亡沒有HIF-1α條件敲除的細(xì)胞那么明顯，這表明HIF至少在一定程度上通過VEGF信號和隨后的血管生成來調(diào)節(jié)細(xì)胞生存。事實(shí)上，轉(zhuǎn)基因VEGF164的表達(dá)[16]并不能完全挽救HIF-1α突變小鼠軟骨細(xì)胞的死亡，這說明依賴HIF的細(xì)胞可以自主調(diào)控細(xì)胞存活。HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)糖酵解酶過程中磷酸甘油酸激酶-1的表達(dá)來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的代謝[16]，從而在低氧情況下存活。此外，HIF-1α還控制軟骨細(xì)胞的增殖以及基質(zhì)的合成和修飾[22-23]。然而，增殖效應(yīng)主要發(fā)生在骨化中心邊緣，且HIF-1α僅適度表達(dá)，這可能是中心細(xì)胞死亡的代償性反應(yīng)。

骨化中心低氧信號通路的局部激活提示HIF水平必須在其他無血管區(qū)域被嚴(yán)格調(diào)控。最近研究證明了PHD2調(diào)控的HIF-1α失活對于避免代謝誘導(dǎo)的骨骼發(fā)育不良是必要的。事實(shí)上，PHD2缺失導(dǎo)致HIF-1α不能被激活，會降低葡萄糖氧化，從而限制軟骨細(xì)胞的增殖和骨的縱向生長。此外，谷氨酰胺衍生物與α-KG的增加可以使膠原過度修飾和骨量增加[24]。在表達(dá)膠原蛋白的軟骨細(xì)胞中，pVHL的缺失降低了細(xì)胞增殖，增加了骨化中心內(nèi)基質(zhì)的沉積[23]，進(jìn)一步支持了維持適當(dāng)?shù)腍IF水平的調(diào)節(jié)機(jī)制對正常骨發(fā)育的重要作用。

因此，HIF-1α是骨化中心內(nèi)軟骨細(xì)胞的生存因子。雖然無血管環(huán)境，但是HIF的水平必須嚴(yán)格控制，以避免代謝誘導(dǎo)的骨骼發(fā)育不良。

3 通過HIF和PHD維持出生后骨穩(wěn)態(tài)

雖然成骨的外觀不會發(fā)生變化，但通過破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成不斷更新[1-2]。與骨化中心相比，骨髓高度的血管化，這些血管為骨細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為造血干細(xì)胞和骨母細(xì)胞提供生存環(huán)境[3]。盡管骨是高度血管化的器官，但骨微環(huán)境的特定區(qū)域含氧量較低[4]。成骨細(xì)胞的低氧信號通路參與了血管生成以及成骨和血管生成過程之間的耦合。骨母細(xì)胞或成熟成骨細(xì)胞中HIF-1α條件性缺失導(dǎo)致骨體積和血管數(shù)量減少，血管數(shù)量減少是由于局部VEGF生成下調(diào)所致[25-26]。然而通過pVHL或PHD在骨膜細(xì)胞中缺失而激活HIF通路則結(jié)果相反。血管密度的變化是一個(gè)重要的驅(qū)動因素，但骨膜細(xì)胞的HIF信號也控制骨穩(wěn)態(tài)和骨細(xì)胞功能，且不依賴于血管生成的增加[27]。最近的研究顯示，首先在出生后小鼠的Osx陽性骨母細(xì)胞中，穩(wěn)定的HIF-1α使小梁骨數(shù)量增加，這與骨血管的增加有關(guān)。然而，骨量增加并不繼發(fā)于血管生成的增加，而是依賴于骨母細(xì)胞糖酵解的上調(diào)，但是VEGF的條件性缺失，完全逆轉(zhuǎn)了HIF-1α依賴的骨形成[28-29]。糖酵解增加究竟如何促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成仍然未知。其次，成骨細(xì)胞低氧信號通路的激活也會影響與其他骨骼細(xì)胞的相互作用，從而調(diào)節(jié)HIF依賴的骨穩(wěn)態(tài)。實(shí)際上，在Osx陽性祖細(xì)胞中聯(lián)合滅活PHD2和PHD 3可通過減少骨保護(hù)素(osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG)及HIF驅(qū)動的破骨活動，從而增加骨量[30]。此外，在骨細(xì)胞中HIF激活后，抑制了骨硬化蛋白的表觀遺傳，使骨形成增加、骨吸收減少，骨量增加[27，31]。最后，骨祖細(xì)胞中HIF信號的增強(qiáng)導(dǎo)致骨量增加，同時(shí)增加造血干細(xì)胞和紅細(xì)胞系的選擇性增殖。事實(shí)上，pVHL基因消融及PHD1/2/3基因聯(lián)合缺失，或用藥物抑制PHD，可以增加造血干細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的數(shù)量，從而增加經(jīng)過高強(qiáng)度輻射的小鼠細(xì)胞的存活數(shù)量。此外，突變小鼠出現(xiàn)了紅細(xì)胞增多癥，這是由HIF增加成骨細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)所致。值得注意的是，該模型中造血干細(xì)胞的增加可能部分依賴于血管生成，因?yàn)楣悄讣?xì)胞中HIF信號的激活導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)的骨髓血管系統(tǒng)的生長[28]，而骨髓血管系統(tǒng)是HSCs存在的關(guān)鍵部位[32](見圖1)。

圖1 HIF和PHD維持出生后骨穩(wěn)態(tài)示意圖

最近的數(shù)據(jù)表明，成骨細(xì)胞中HIF信號的增加可能直接或間接地誘導(dǎo)EPO生成，從而調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23)水平。正常情況下，F(xiàn)GF23主要由骨細(xì)胞產(chǎn)生，這種激素在腎臟磷酸鹽的重吸收和產(chǎn)生1，25-二羥維生素D3時(shí)減少。后者是由1a-羥化酶表達(dá)減少和24-羥化酶水平升高引起的。與礦物質(zhì)有關(guān)的因素是FGF23的主要調(diào)節(jié)因子，如磷酸鹽、1，25-二羥維生素D3和甲狀旁腺激素為正向調(diào)節(jié)因子[33]。然而，人們逐漸證實(shí)了包括HIF和EPO在內(nèi)的非礦物因子調(diào)節(jié)FGF23產(chǎn)生及裂解。只有全段成纖維細(xì)胞生長因子23(intact fibroblast growth factor23，iFGF23)才具有生物活性，而裂解片段的作用尚不完全清楚。HIF-1α可能由炎癥或缺鐵引起[34]，可與FGF23啟動子結(jié)合，增加其在成骨細(xì)胞中的表達(dá)[35]。X-連鎖低磷酸鹽血癥是一種具有高生物活性的FGF23水平的疾病。在模擬這種疾病的羥脯胺酸小鼠模型中，HIF-1α信號在成熟成骨細(xì)胞中的失活既沒有改變血清中iFGF23水平，也沒有改變骨穩(wěn)態(tài)，這表明在本模型中成骨細(xì)胞HIF和FGF23之間沒有聯(lián)系[36]。然而，HIF信號在其他骨膜細(xì)胞和非骨細(xì)胞中的作用不能排除。除了直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，HIF-1α還可能通過促進(jìn)EPO的產(chǎn)生而增加FGF23水平。EPO增加了FGF23的轉(zhuǎn)錄和FGF23的裂解，因?yàn)轶w內(nèi)FGF23水平與iFGF23水平的增加不成比例[37-39]。在一些研究中，血清FGF23水平的升高與血清磷酸鹽或1，25-二羥維生素D3的水平降低有關(guān)，這反過來可能改變骨骼的穩(wěn)態(tài)[37]。EPO通過靶向骨髓中的非骨細(xì)胞，包括紅細(xì)胞系和造血干細(xì)胞，對FGF23表達(dá)產(chǎn)生影響[37-39]。然而，EPO調(diào)控FGF23轉(zhuǎn)錄和裂解的機(jī)制尚未完全闡明。在人類中觀察到EPO和FGF23水平之間也存在相似的關(guān)聯(lián)，F(xiàn)GF23總水平的增加大于全段FGF23水平的增加[37-39]。FGF23片段的增加是否具有病理生理學(xué)意義仍有待闡明。綜上所述骨骼功能正常需要HIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過代謝適應(yīng)直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能，并通過局部分泌VEGF、OPG、骨硬化蛋白和EPO間接影響骨髓內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞和造血細(xì)胞，而EPO又可能改變FGF23水平及骨穩(wěn)態(tài)。

幾項(xiàng)研究表明，HIF對正常骨發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，保護(hù)骨骼細(xì)胞免受低氧的損害[8]。血管生成的增加和代謝的適應(yīng)是促進(jìn)機(jī)制，但缺乏對HIF驅(qū)動成骨細(xì)胞代謝的全面認(rèn)識。在軟骨細(xì)胞中，大量的HIF影響代謝平衡，并誘導(dǎo)骨骼發(fā)育不良。除了調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和骨量，最近在骨骼細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)了一些新的HIF的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可以影響其他類型的細(xì)胞，包括減少破骨發(fā)生的OPG和促進(jìn)紅細(xì)胞生成的EPO。EPO除了在調(diào)節(jié)造血細(xì)胞方面的作用外，還可能增加FGF23的生成和裂解，但其機(jī)制仍有待確定。此外，成骨性HIF在EPO-FGF23通路中的作用還需要進(jìn)一步用成骨細(xì)胞和/或腎特異性滅活HIF或PHD的小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。這些發(fā)現(xiàn)對于PHD抑制劑治療慢性腎病性貧血、骨發(fā)育不良及骨質(zhì)疏松的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。