低壓靜電場處理對竹節蝦(Penaeus japonicus)微凍貯藏過程中品質的影響

王杏娣,謝 超,梁瑞萍,張家瑋,余 銘,張海玲

(1.浙江國際海運職業技術學院,浙江舟山 316021;2.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022;3.浙江馳力科技股份有限公司,浙江舟山 316022;4.舟山富晟食品科技有限公司,浙江舟山 316022)

微凍保鮮是在已探明水產品冰點的情況下,將貯藏溫度下降到其冰點下1～2.5 ℃,從而降低水產品體內微生物代謝與酶活性,進而達到保鮮目的的一種方法[3]。在此溫度下貯藏的水產品,體內自由水不易流動和凍結,這些不易流動的水自動形成低溫屏障,可以降低溫度的波動對水產品品質的影響。Duun等[4]研究了四個不同溫度貯藏條件下大西洋鮭魚品質、質構、微觀結構的變化,發現在-1.4～3.6 ℃的微凍貯藏能夠大幅延長鮭魚的保藏期。

目前研究表明,靜電場能延長水產品儲藏時間。靜電場保鮮功效是通過改變細胞內部生物大分子理活性來達到的[5]。根據電場對微生物細胞中作用目標的不同,可將電場對微生物的抑制機制分為兩個方面:一方面電場的存在影響了細胞的分裂速度。細胞在分裂過程中大量存在的紡錘體微管蛋白都具有很大的偶極具,電場會加劇扭曲或積累程度,抑制細胞分裂;另一方面電場會影響細胞內源酶促反應平衡。根據酶與底物作用的模型可以知道,電荷分布會隨著酶與底物分子之間結合時構象的變化而變化,繼而影響酶促反應。有研究發現,高壓電場在羅非魚肉片的保鮮過程中對微生物的增長有明顯抑制,減緩了pH的波動幅度,魚眼渾濁度有了顯著改善[6]。李俠等[7]發現低壓靜電場與放電板隔距45 cm時牛肉的汁液損失率降低了4.18%,解凍效果亦優于無電場組。李苑等[8]發現3000 V電壓靜電場對三疣梭子蟹處理后,脂肪氧化程度與微生物總數均得到了抑制,同時也延長了貨架期。高壓靜電場對果蔬類食品保鮮效果好,但高強度的電壓可能會造成一些不安全隱患,這種局限性使其無法應用于大規模水產品保鮮;低壓靜電場布置簡單,方便快捷,但單一低壓靜電場的低電壓抑菌能力弱,保鮮效果不明顯。目前對微凍保鮮的研究有很多,主要應用于水產品、肉制品等領域[3],但微凍貯藏與低壓靜電場聯合進行水產品保鮮技術研究幾乎沒有,其應用領域值得探索。

本文以舟山竹節蝦為原材料進行對照試驗,通過對0～28 d內竹節蝦冰點、pH、汁液流失率、揮發性鹽基總氮(TVB-N)、菌落總數(TVC)、硫代巴比妥酸值(TBA)、質構分析(TPA)等理化指標分析以及組織微觀結構觀察,探索低壓靜電場結合微凍對舟山竹節蝦貯藏過程中品質變化的影響,為蝦類水產品保鮮技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海捕新鮮舟山竹節蝦 購于舟山市東河菜場,放入0 ℃水產保鮮盒內快速運至實驗室;乙醇、鹽酸、氧化鎂、2-硫代巴比妥酸、硼酸 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉 優級純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;三氯乙酸 優級純,上海麥克林生化科技有限公司;磷酸緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;多聚甲醛(RT) 生工生物工程(上海)股份科技有限公司;蘇木精、伊紅 分析純,成都普思生物科技股份有限公司。

DSC200F3差示量熱掃描儀 德國耐馳公司;TMS-PRO食品物性分析儀 美國FTC公司;FB124電子天平 上海儀天科學儀器有限公司;高精度數顯勻漿機 IKA公司;U-5200紫外可見分光光度計 日本日立公司;GJ-3S高速攪拌機 日本EYELA公司;多用水浴恒溫振蕩器 上海喆圖科學儀器有限公司;TG16B高速臺式離心機 湖南凱達公司;HZQ-F160全溫振蕩培養箱 常州申光儀器有限公司;PB-10酸度計 賽多利斯公司;BCD-206STPQ冰箱 海爾集團有限公司;PROTOCOL3自動菌落分析儀 英國Synbiosis;SE&BA鮮霸電場裝置 浙江馳力科技公司;低壓靜電放電板 浙江馳力科技公司;HM325石蠟切片機 北京恒三江儀器銷售有限公司;DYP-990顯微鏡 上海點應光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理與電場設置 將舟山竹節蝦清洗至無明顯污染,去除水分后裝袋置于-4 ℃冰箱保鮮待用。低壓靜電場發生裝置由一臺SE&BA鮮霸主機和三塊低壓靜電放電板組成,整套電場設備安裝在冰箱內部后通電即可產生低壓靜電環境,后續的實驗中實驗組樣品均放置在冰箱內。

1.2.2 樣品分組 對照組:無靜電場,-4 ℃條件下貯藏的竹節蝦;實驗組:添加靜電場發生設備(輸入電壓220 V、輸出電流0.2 mA),-4 ℃條件下貯藏的竹節蝦,為更好探究電場對對竹節蝦微凍過程中品質的影響,按照每組處理量100 g,每次取樣量10 g,將測定間隔時間梯度增加,分別于0、3、6、10、15、21、28 d時測定各項理化指標。

“在我這里，沒有不可能的事。”范堅強堅定地說。那副自信表情，讓一杭開始動搖了，但他相信，雪螢絕不會背叛自己，唯一的解釋是，雪螢找到記事本，但被范堅強的人奪走了。

1.2.3 DSC法對冰點的測定 DSC法測定冰點主要參考楊宏旭[9]對淡水魚冰點的測定方法并加以改進。開始測量前,提前60 min開啟儀器和計算機,稱取試樣5～15 mg,置于銀質坩堝內,用鑷子在鍋蓋上輕輕戳個小洞,然后蓋上鍋蓋,用密封壓機密封處理后進行掃描參數設置。參數設定:范圍(-40 ℃/5.0 K/min)/15 ℃;溫度矯正(TCALZERO.TXM);氣氛(AIR80/20-/NITRO GEN/20/NITRO GEN/20)。

1.2.4 pH的測定 取5 g竹節蝦肉攪拌后置于15 mL離心管中,加入10 mL超純水后于均質機均質樣品1 min,用PB-10酸度計測定樣品pH。

1.2.5 汁液流失率的測定 參考Wilkinson等[10]的方法,取出包裝好的竹節蝦進行稱重試驗,將減去包裝袋表面水分的剩余質量記為W1,將濾去包裝袋內液體和表面水分的剩余重量記為W2,將包裝袋質量記為W3,進行汁液流失率測算。汁液流失率計算公式為:

1.2.6 TVB-N的測定 參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[11]中半微量定氮法進行竹節蝦TVB-N的測定。

1.2.7 TVC的測定 參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[12]進行竹節蝦菌落總數的測定。

1.2.8 TBA的測定 將竹節蝦置于20 ℃室溫下自然解凍,去頭去尾,稱取10 g蝦肉,攪碎后于燒杯中加入25 mL超純水和5%三氯乙酸充分勻漿后攪拌均勻靜置1 h,用上述濃度三氯乙酸將濾液定容至50 mL后取上清液5 mL并加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液于10 mL具塞管振蕩10 min,置于80 ℃水浴鍋反應50 min,冷卻一段時間后在532 nm處測定吸光度。TBA值計算公式為:

式中,X:TBA值(mg/kg);C:式樣丙二醛濃度(μg/mL);V:樣品溶液定容體積(mL);m:竹節蝦質量(g);1000:換算系數。

1.2.9 TPA的測定 用TMS-PRO食品物性分析儀對竹節蝦質構特性進行測算,測定指標包括硬度與彈性。參數設定:測量前探頭下降速度3.0 mm/s，觸發力5 g,測試速度為1.5 mm/s;測量后探頭回程速度2.0 mm/s,下降距離5 mm,數據采集速率1/150 s,探頭類型P/50。測試時需要注意探頭下壓方向應垂直于竹節蝦肌肉纖維走向。

1.2.10 組織微觀結構分析 參考胡玥等[13]的方法并稍作修改,取竹節蝦背部肌肉截成長寬高6 mm的立方體肉塊,放入多聚甲醛溶液固定36 h,梯度乙醇脫水,二甲苯透明樣品,隨后將肉塊置入-18 ℃冷凍30 min,浸臘包埋,將肉塊切成0.8 mm薄片,用蘇木精-伊紅染液染色,上電子顯微鏡觀察。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 8進行數據處理,采用Origin 2018 64Bit對數據作圖,采用Proteus軟件對掃描曲線進行分析,采用SPSS Statistics 21分析,P<0.05差異顯著,P>0.05無顯著差異,所有樣品進行三次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 舟山竹節蝦冰點的確定

圖1是竹節蝦的DSC升溫掃描曲線。根據Bai等[14]對蘋果冰點測定方法與楊宏旭[9]對青魚的冰點測定方法,DSC熱流曲線上的吸熱峰對應水產品結晶的熔程,因此熔融峰爬升途中左側拐點-0.3 ℃做切線與基線的交點所點即為樣品的冰點。可以看出圖1中該點所對應的溫度為-1.8 ℃,可得出竹節蝦的冰點為-1.8 ℃。本實驗采用微凍貯藏作為保鮮方式,因微凍保鮮需要將貯藏溫度保持在水產品冰點下1～2.5 ℃,結合實際儀器設備采用低于冰點2.2 ℃的溫度,即-4 ℃對竹節蝦進行保藏。

圖1 舟山竹節蝦DSC升溫掃描曲線Fig.1 DSC heating scan curve of Zhoushan Penaeus japonicus

2.2 舟山竹節蝦不同貯藏條件pH的變化

pH是判定水產品新鮮度的重要指標,同時也能準確反映出水產品貯藏過程中品質的變化。圖2中初始pH為6.54,隨時間變化兩組竹節蝦都表現出了先降后升的趨勢。水產品捕撈上岸后,細胞失去了血液對其的氧氣供應,從而產生乳酸,造成肌肉pH的下降;隨微生物繁殖與酶的降解,蛋白質分解為含氮類堿性物質,造成肌肉pH升高[15]。對照組竹節蝦pH在15 d降至6.26達到最低,之后又逐漸升高,于28 d達到6.38,波動幅度較大;實驗組竹節蝦的pH亦有先升后降的趨勢,但波動幅度維持在初始值±0.04的范圍內,波動幅度較小。李來好等[16]認為水產品貯藏過程中pH波動范圍越小,水產品的新鮮度越好。兩組竹節蝦貯藏時pH差異顯著(P<0.05),可能是電場加快了乳酸在體內的分解速率,使pH維持在較為穩定的狀態[17]。可以看出低壓靜電場結合低溫對竹節蝦貯藏過程中能維持pH相對穩定。

圖2 不同貯藏條件下舟山竹節蝦pH的變化Fig.2 Changes of pH of Zhoushan Penaeus japonicus under different storage conditions注:圖中不同字母表示數據有顯著性差異(P<0.05),其中大寫字母表示同一天內對照組與實驗組之間比較,小寫字母表示相同處理下0～28 d內比較;圖3～圖7同。

2.3 舟山竹節蝦不同貯藏條件汁液流失率的變化

低溫貯藏會因為溫度波動等問題造成水產品體內汁液的流失,影響解凍后的品質[16]。由圖3可得,在0～28 d的時間里竹節蝦的汁液流失率呈現上升趨勢,但當貯藏時間>0 d時,實驗組汁液流失率均低于對照組。3 d時實驗組與對照組汁液流失率分別為2.32%、1.22%,6 d時分別為3.98%和2.24%。可以看出,電場在貯藏至6 d時對竹節蝦汁液流失率影響并不顯著(P>0.05)。貯藏初期水產品肌肉組織完整,大冰晶尚未生成,僅有少部分自由水流失。28 d時實驗組汁液流失率為5.01%,遠低于對照組第15 d時汁液流失率5.95%,與對照組第10 d時汁液流失率4.98%相當。6～28 d低壓靜電場對竹節蝦保鮮效果有顯著影響(P<0.05)。有研究表明,靜電場可對自由水與不易流動水的流動進行一定程度的限制,這些水匯聚成保護膜保護結合水不流失,從而減緩水產品結合水和不易流動水的損失[18]。這說明-4 ℃低壓靜電場能減少竹節蝦汁液流失量。

圖3 不同貯藏條件舟山竹節蝦汁液流失率的變化Fig.3 Changes of juice loss rate of Zhoushan Penaeus japonicus under different storage conditions

2.4 舟山竹節蝦不同貯藏條件TVB-N的變化

TVB-N是蛋白質分解后產生的堿性含氮物質的統稱,TVB-N水平越高代表水產品可食用度越低[19]。圖4可以看出,兩組竹節蝦的TVB-N值都呈現了上升的趨勢。貯藏到第10 d對照組和實驗組TVB-N值分別增長了6.36、3.66 mg/100 g,10～21 d時,兩組竹節蝦TVB-N值分別增長7.73、4.86 mg/100 g,均呈顯著增速增長狀態(P<0.05)。但經過低壓靜電場處理保藏的竹節蝦TVB-N上升速度低于正常微凍的竹節蝦。根據GB 2733-2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》[20]要求,海蝦中TVB-N值應≤30 mg/100 g,第28 d時對照組竹節蝦TVB-N增長至30.42 mg/100 g,超過了國標范圍,已不可食用,而實驗組竹節蝦的TVB-N值僅為22.84 mg/100 g,為可食用狀態。這可能是因為電場對微生物活性與酶活性產生了抑制,減少了堿性物質的產生,表現出低水平的TVB-N值[21]。這表明低壓靜電場協同微凍的保鮮方式在28 d內能減少竹節蝦堿性含氮物質的產量,保證竹節蝦處于可食狀態。

圖4 不同貯藏條件舟山竹節蝦TVB-N的變化Fig.4 Changes of TVB-N in Zhoushan Penaeus japonicus under different storage conditions

2.5 舟山竹節蝦不同貯藏條件TVC的變化

水產品貯藏期間會腐敗變質,這通常是因為微生物生長與代謝產生的硫化物、醛、酮等物質[22],因此抑制微生物生長是提升水產品品質的重要手段。圖5展示了正常微凍和微凍結合低壓靜電場條件下舟山竹節蝦TVC的變化情況,可以看出兩組竹節蝦的TVC隨貯藏時間的變化而增加。貯藏初期0～6 d對照組和實驗組竹節蝦菌落總數均增長迅速,TVC值分別為增長了42.91%和32.57%。有研究表明,在貯藏初期微生物代謝速度和酶活性高于貯藏后期水平,易于造成前期貯藏時高TVC增長速度[23]。貯藏中后期實驗組TVC上升速度低于對照組,第28 d時其TVC值僅為5.48 lg CFU/g,遠遠低于對照組的7.06 lg CFU/g。靜電場通過改變水產品細胞膜的跨膜電位影響微生物生長代謝,對微生物產生了殺滅抑制作用,表現為貯藏期低水平的TVC值[24]。因此,在-4 ℃添加低壓靜電場有助于減少竹節蝦貯藏期菌落總數增長,減緩其腐敗速度。

圖5 不同貯藏條件舟山竹節蝦TVC的變化Fig.5 Changes of TVC in Zhoushan Penaeus japonicus under different storage conditions

2.6 舟山竹節蝦不同貯藏條件TBA的變化

舟山竹節蝦脂肪含量較高,且具有不穩定結構的DHA占比較大,故TBA值一旦超量會產生不愉悅氣味的氣體,營養價值也會大大降低[25]。圖6展示了兩種不同環境下保藏的竹節蝦的TBA值變化,由圖6可以看出,實驗組與對照組TBA值不斷上升,但當貯藏時間大于0 d時,實驗組竹節蝦TBA值仍始終低于對照組竹節蝦。第10～21 d的TBA曲線增長速度明顯低于0～10 d的曲線增長速度,表現出較為平緩的曲線。第28 d,對照組和實驗組TBA值分別達到了0.82、0.58 mg/kg,較第0 d分別增長了0.6和0.36 mg/kg。添加電場貯藏的竹節蝦TBA含量明顯低于沒有添加電場的竹節蝦,與Erkan等[26]得出的結論一致。可能是添加電場后,電荷之間形成了隔絕層,減少了氧氣濃度,從而達到降低不飽和脂肪酸氧化程度的作用[27]。-4 ℃時低壓靜電場的添加可以顯著減緩(P<0.05)竹節蝦脂肪氧化程度。

圖6 不同貯藏條件舟山竹節蝦TBA的變化Fig.6 Changes of TBA in Zhoushan Penaeus japonicus under different storage conditions

2.7 舟山竹節蝦不同貯藏條件TPA的變化

TMS-PRO食品物性分析儀可對食品硬度、彈性、咀嚼性、內聚性等物理性質進行準確量化分析,能避免人為因素對食品品質評價結果的主觀影響,其中硬度和彈性是水產品貯藏時極易發生較大變化的兩個參數[28]。圖7為不同貯藏條件下竹節蝦硬度(a)和彈性(b)的變化。圖7(a)中兩組樣品硬度隨時間變化均呈先上升后下降的趨勢。出現此種現象是因為竹節蝦在保藏過程中水分流失造成其殼肉分離繼而硬度變大,之后硬度下降是因為蝦中酶活力隨時間變化而下降,水結成的冰晶擴大了肌肉組織之間的間隙導致蛋白質變形表現出硬度下降[29]。與實驗組相比對照組硬度值波動幅度更大,對照組和實驗組樣品硬度在貯藏第15 d均達到最高峰,分別為6.42、5.45 kg。這可能是電場的添加延緩了肌肉中水分子的運動,蛋白質變性程度低。圖7(b)為兩種環境下竹節蝦的彈性變化,實驗組和對照組均呈下降趨勢。貯藏至28 d時,對照組和實驗組兩組竹節蝦彈性分別下降了41.49%和26.60%。貯藏過程中蝦體內肌球蛋白、肌動蛋白被分解,分解釋放的熱量會使肌肉纖維收縮變軟[30]。其次竹節蝦在貯藏過程中,組織成分的腐敗分解也會降低細胞的彈性。在貯藏期達到28 d時,實驗組仍比對照組彈性值高14.89%。低壓靜電場中的正負電荷能降低蛋白質的分解速率,尚未被分解的細胞骨架蛋白可以阻礙大冰晶的產生[31],繼而在整個貯藏期維持高水平的彈性。據此,竹節蝦口感和品質的提升得益于低壓靜電場結合微凍保鮮對質構特性的改善。

圖7 不同貯藏條件舟山竹節蝦硬度(a)和彈性(b)的變化Fig.7 Changes of hardness(a)and elasticity(b)of zhoushan Penaeus japonicus in different storage conditions

2.8 舟山竹節蝦不同貯藏條件組織微觀結構的變化

H&E染色是觀察1～100 μm范圍組織微觀結構最常用的方法,該法中蘇木精-伊紅染液對肌肉組織染色效果好,能觀察到不同時期竹節蝦中肌纖維走向與冰晶分布。圖8分別展示了第3、15、28 d時不同條件貯藏的竹節蝦肌肉組織結構縱向剖面變化。由圖8(a)和圖8(b)可以看出,3 d時兩組竹節蝦肌肉組織較為完整,無大的縫隙和冰晶,對照組竹節蝦有微小縫隙;實驗組竹節蝦肌間縫隙少且小,肌肉結構更加完整排列更加整齊。從圖8(c)和圖8(d)圖可以發現,貯藏到15 d對照組竹節蝦肌肉組織附著了大量冰晶且出現了大小不一的間隙;實驗組竹節蝦肌肉組織仍十分均勻。貯藏到第28 d,對照組肌肉纖維之間產生了明顯斷裂和無規律擴散,肌纖維間隙因為冰晶的作用被明顯擴大,肌內膜被完全破壞;實驗組肌肉纖維連接依舊緊密無太大間隙,未見大冰晶生成。魚類體內水分會隨溫度降低結晶,而貯藏期理化性質的改變會造成蝦體內部溫度波動導致冰晶重結晶[32]。通常冰晶融化后流動到其他位置亦會加劇微觀組織結構的破損,但低壓靜電場的添加可以減緩微凍貯藏時竹節蝦理化性質變化程度,改變物料的結冰點,降低肌肉組織結構破壞程度。

圖8 舟山竹節蝦不同貯藏條件肌肉組織微觀結構變化Fig.8 Microstructure changes of muscle tissue in different storage conditions of Zhoushan Penaeus japonicas注:a、c、e分別表示對照組貯藏3、15、28 d的組織微觀結構;b、d、f分別表示實驗組貯藏3、15、28 d的組織微觀結構。

3 結論

電場結合微凍條件下保鮮竹節蝦相對普通微凍,能夠更好地保持舟山竹節蝦在貯藏過程中的品質,延緩了酶和微生物對肌肉組織的損害,延緩了脂肪氧化速率,肌肉保持了較好的彈性和咀嚼性。另外電場處理后,阻止了大冰晶的產生,肌肉微觀組織破壞程度也相對較低。低壓靜電場的添加可以有效延緩竹節蝦貯藏過程中的品質變化,竹節蝦品質較好,pH波動范圍≤0.04,汁液流失率僅為5.01%,TVB-N、TVC值遠低于對照組,脂肪氧化程度顯著降低(P<0.05),硬度和彈性下降緩慢,經H&E染色亦發現微觀肌間結構完整,縫隙數量很少,無明顯冰晶,經保鮮處理28 d后的竹節蝦處于可食狀態。該項技術成果對改變傳統水產品的保鮮方式具有重要的指導意義。