一株高產丁酸的丁酸梭菌分離鑒定及其生物學性質研究

高文文,尚佳萃,周 雪,范小飄,李欣芮,趙 桉,趙鵬昊,趙 樂,孟祥晨

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

人類腸道中定殖著大量的微生物,它們可以為機體提供營養并維持腸道健康。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是一類產芽孢的革蘭氏陽性嚴格厭氧菌,最初分離于人類糞便。同時,也存在于土壤、污泥等自然環境中[1]。丁酸梭菌因其具有芽孢,所以具有較好的耐酸、耐膽鹽等特性,從而可以更好地發揮維持腸道菌群平衡、促進有益菌增殖、抑制病原微生物、抗炎、促進動物生長、提高機體免疫力等益生功能[2-6]。因此,研究人員常將丁酸梭菌作為微生態制劑添加到食品、藥品、飼料等多種領域以發揮多種益生作用[7-9]。近年來發現丁酸梭菌的許多益生作用可以歸因于其代謝產物——丁酸,這是一種短鏈脂肪酸,對人類腸道發揮著重要的作用。它是人腸道上皮細胞的主要營養來源[10],保持一定水平的丁酸能夠使結腸細胞保持穩定,進而發揮抑制癌癥、調節腸道菌群失調等多種功能[11]。但當從食物中攝取丁酸時,其還未到達結腸發揮作用就已經被人體消化吸收,導致其很難發揮益生功能,因此,能在腸道部位產丁酸的細菌(如丁酸梭菌)就顯得尤為重要。已有一些研究者從不同的生境分離出丁酸梭菌,謝樹貴等[12]、袁華偉等[13]分別從窖泥中分離得到ClostridiumbutyricumB1和YD-4,王騰浩等[14]從豬糞中分離得到一株ClostridiumbutyricumZJU-F1,其在RCM梭菌增殖培養基中分泌丁酸的產量為1.87 g/L左右,廖秀冬[15]從土壤、污泥、豬和牛的新鮮糞便中分離得到多種Clostridiumbutyricum,其中在RCM液體培養基中培養后的丁酸產量最高為1.58 g/L。也有研究者從人類糞便中分離獲得丁酸梭菌,Benamar等[16]從新生兒糞便樣品中分離得到15株丁酸梭菌;楊帆[17]、楊金梅[18]、趙建新等[19]也分別從健康成人糞便中篩選到不同的丁酸梭菌。腸道內主要產丁酸細菌除了丁酸梭菌外,還包括普拉梭菌(Fusobacteriumprauznitzii)、羅氏弧菌(Roseburiaintestinalis)、霍氏真桿菌(Eubacteriumhallii)以及Butyricicoccuspullicaecorum等。方超等[20]從健康成人糞便中分離得到Fusobacteriumprauznitzii,其丁酸產量最高為1.4 g/L;Duncan等[21]從健康嬰兒的糞便中分離得到五株Roseburiaintestinalis,其中丁酸產量最高為1.2 g/L,最低僅為0.8 g/L;同樣地,Eeckhaut等[22]從雞糞中篩選得到的Butyricicoccuspullicaecorum的丁酸產量也僅為1.1 g/L。綜上所述,這些丁酸產生菌的丁酸產量都不高。有研究表明Clostridiumbutyricum是最有效的丁酸產生菌,在以葡萄糖作為碳源的分批發酵中丁酸產量可高達60 g/L[23]。從另一方面來說,F.prausnitzii和B.pullicaecorum等這類產丁酸細菌對氧極度敏感,即使在厭氧條件也很難存活,而相對來說C.butyricum較易培養,并且它又同時具備芽孢桿菌和乳酸菌的優點,其即具備較強的抗脅迫能力,又能在腸道這樣的厭氧環境中生長良好,并產生乳酸和丁酸。因此,丁酸梭菌是一種極具潛力的能夠生成丁酸的益生菌。

本研究旨在從健康人糞便中分離篩選高產丁酸的丁酸梭菌,并研究其生長特性、耐受特性、抗生素抗性等性質,從而為優良丁酸梭菌的應用開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糞便樣品 采集哈爾濱地區,年齡在20～25歲之間健康成人的新鮮糞便6份,在采樣前一個月內,所有志愿者均未服用任何抗生素類藥物,采集的新鮮糞便置于糞便還原液(L-半胱氨酸鹽酸鹽3 g/L,大豆蛋白胨2 g/L,121 ℃滅菌15 min[24])中迅速帶回實驗室;牛膽鹽、胃蛋白酶(456 U/mg)、胰蛋白酶(3000 U/mg)、丁酸(色譜純) 美國Sigma公司;濃硫酸 天津化學試劑一廠;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;細菌微量生化反應管、藥敏紙片 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純產品。

厭氧培養罐、SPH-100生化培養箱 上海佳勝實驗設備有限公司;Uvmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司;LW40B光學顯微鏡 上海光學儀器一廠;HH-1恒溫水浴鍋 萬豐儀器制造有限公司;E2695Waters高效液相色譜儀 Waters公司;9700PCR擴增儀 美國Applied biosystem公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 RCM梭菌增殖培養基:牛肉粉10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉3.0 g、可溶性淀粉1.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉3.0 g、NaCl 5.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、瓊脂20.0 g(固體培養基時用)、蒸餾水加至1000 mL,pH調至6.8±0.2,121 ℃高壓滅菌15 min。

TSN梭菌選擇性培養基:酵母浸膏10.0 g、胰蛋白胨15.0 g、亞硫酸鈉1.0 g、檸檬酸鐵0.5 g、硫酸新霉素0.05 g、多粘菌素B 0.02 g、蒸餾水加至1000 mL,pH調至7.2±0.1,121 ℃高壓滅菌10 min,固體培養基加入瓊脂13.5 g。

1.2.2 菌株的分離與培養 取采集的新鮮糞便與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合均勻后,于80 ℃條件下水浴10 min,然后在無菌操作臺中吸取糞便稀釋液于RCM梭菌增殖培養基中,并在37 ℃條件下厭氧培養48 h;然后將培養后樣品進行梯度稀釋,取適當稀釋度下的稀釋液涂布于TSN梭菌選擇性培養基中,并在37 ℃條件下厭氧培養48 h;挑取菌落形態為不規則圓形、表面濕潤光滑的單菌落進行平板劃線,然后分別進行有氧、厭氧培養,從而選取嚴格厭氧的菌株進行鏡檢,所得到的符合丁酸梭菌菌體特征的革蘭氏染色陽性菌株進行隨后的試驗[15]。

1.2.3 分離株產丁酸含量的測定 將從糞便中初步分離得到的丁酸梭菌疑似株以5%的接種量接種于RCM梭菌增殖培養基中,37 ℃厭氧培養16～20 h,連續液體培養2～3代,以保證菌株活力后進行后續試驗。將活化好的丁酸梭菌疑似株接種到RCM液體培養基中培養24 h,取發酵液離心(12000 r/min,10 min)處理得到上清液后,采用高效液相色譜法測定發酵液中丁酸含量。丁酸的保留時間為24.571 min,質量濃度(g/L)與峰面積的回歸方程為:y=1051800x(x代表質量濃度,y代表峰面積),其決定系數R2=1.000。

色譜條件[25]:色譜柱:Biorad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm);流動相:5 mmol/L硫酸溶液;檢測波長:210 nm;流速:0.5 mL/min;柱溫:50 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.4 分離株鑒定

1.2.4.1 形態學特征 將篩選得到的菌株梯度稀釋后涂布于RCM固體培養基中,厭氧培養24 h后觀察菌落形態,并取單菌落進行革蘭氏染色后,于光學顯微鏡下觀察菌體形態。

1.2.4.2 生理生化試驗和糖發酵試驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》[26],對分離株進行過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、水解明膠試驗、水解酪蛋白試驗、運動性試驗以及糖發酵試驗。

1.2.4.3 16S rDNA同源性分析 細菌基因組DNA的提取、16S rDNA基因片段擴增反應的上下游引物、PCR擴增反應總體系以及擴增條件參照張秋雪等[24]的方法。

最后將擴增后得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,若擴增產物長度為1500 bp左右且無雜帶,再將其送至測序公司進行雙向測序。將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對后,運用MEGA 7軟件并采用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹,Bootstrap設置為1000。

1.2.4.4 多位點序列分型(MLST) 對分離株的七個管家基因進行PCR擴增并測序,其七個管家基因的上下游引物見表1[16]。

表1 丁酸梭菌MLST擴增引物Table 1 The MLST primers of Clostridium butyricum

管家基因的擴增體系與16S rDNA基因的擴增體系相同,其擴增反應條件為94 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸10 min。將各個管家基因擴增產物的測序結果按順序拼接并經BLAST比對后,構建系統發育樹,進一步分析分離株的親緣關系。

1.2.5 分離株生長曲線和丁酸生成量曲線的測定 按照5%的接種量將活化后的菌株接種于RCM液體培養基中,37 ℃厭氧培養24 h,每間隔2 h取1次培養液,測其OD600值、pH以及丁酸生成量,然后以取樣時間為橫坐標,OD600值、pH和丁酸生成量為縱坐標繪制生長曲線圖和丁酸生成量曲線圖。

1.2.6 耐受性試驗 a.收集菌體:將充分活化好的待測菌株以5%的接種量接種于RCM液體培養基中,37 ℃厭氧培養12 h,即得菌懸液。然后取一定量的菌懸液進行離心處理(8000 r/min,10 min)以收集菌泥,并用PBS緩沖液洗滌兩次。

b.酸耐受性:用PBS緩沖液將洗滌后的菌泥重懸,并將菌懸液的pH分別調節為2.0和3.0,然后于培養0、1和3 h時取樣測定酸耐受性[27]。

c.膽鹽耐受性:將洗滌后的菌泥重懸于0.3%、0.5%和1%濃度的膽鹽溶液中,在37 ℃條件下厭氧培養0、4和8 h后取樣測定膽鹽耐受性[27]。

d.模擬消化道耐受性:本試驗模擬菌體經過唾液、胃液以及腸液的消化過程。唾液、胃液以及腸液的具體配制方法參照Barmpalia-davis等的方法[28]。將洗滌后的菌體進行模擬唾液消化5 min,胃液消化2 h,腸液消化2 h[29]。

e.存活率的測定:取樣后進行梯度稀釋,取適宜濃度梯度涂布于RCM固體培養基中,37 ℃厭氧培養48 h后進行菌落計數。采用平板菌落計數法計數耐受性試驗起始和結束后的活菌數量,然后計算存活率。

1.2.7 抗生素抗性試驗 本試驗采用藥敏紙片擴散法[30]。將待測菌株以5%的接種量接種于RCM液體培養基中,37 ℃厭氧培養12 h后,吸取0.1 mL菌懸液均勻涂布于RCM固體培養基上,待培養基表面干燥后,分別鑷取各種藥敏紙片貼于培養基表面,37 ℃厭氧培養48 h后,用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3 數據分析

以上所有試驗均進行3次重復。運用Origin 9.0對試驗所得數據進行繪圖,運用SPSS 23進行差異性分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 分離株的篩選及其所產丁酸含量

選取6份健康成人的新鮮糞便進行梯度稀釋以及涂布平板,隨機挑取14株單菌落,其顯微形態和丁酸產量見表2。根據丁酸梭菌的菌體形態、芽孢位置、是否嚴格厭氧、生理生化特征以及丁酸產量篩選得到1株高產丁酸的菌株,在RCM培養基中培養24 h后發酵液中丁酸含量達到2.156 g/L,將其命名為C1-6。本研究獲得菌株的丁酸產量高于王騰浩等[14](ClostridiumbutyricumZJU-F1,在RCM培養基中丁酸生成量為1.87 g/L)和廖秀冬等[15](ClostridiumbutyricumNF3,在RCM丁酸生成量為1.58 g/L)的結果。

表2 分離菌株的菌體形態和丁酸產量Table 2 Microscopic morphology and butyric acid production of isolated strains

2.2 分離株的鑒定

2.2.1 形態學特征 分離株C1-6在RCM固體培養基上培養24 h后,菌落直徑為1～3 mm,乳白色、稍透明、不規則圓形、邊緣不整齊、表面濕潤光滑、菌落挑起后成拉絲狀(圖1A)。菌體成短桿狀,單個或成對出現,芽孢次端生,革蘭氏染色陽性(圖1B)。

圖1 分離株C1-6菌落(A)及菌體(B)形態Fig.1 Colony(A)and cell morphology(B)of isolated strain C1-6

2.2.2 生理生化及糖發酵試驗 經生理生化和糖發酵試驗后,根據伯杰氏細菌鑒定手冊的描述[26],丁酸梭菌為硝酸鹽還原陽性,過氧化氫酶、水解明膠與酪蛋白陰性,蜜二糖和淀粉利用陽性,松三糖利用陰性等初步確定分離株C1-6為丁酸梭菌(表2)。

表2 分離株的生理生化和糖發酵鑒定結果Table 2 Physiological biochemical and sugar fermentation identification results of isolated strains

2.2.3 16S rDNA序列同源性分析 以分離株C1-6的DNA為模板,采用通用引物進行PCR擴增反應,獲得約1500 bp長度的擴增產物,將測序拼接結果進行同源性分析并構建系統發育樹(圖2),結果顯示分離株C1-6與ClostridiumbutyricumCDC51208和ClostridiumbutyricumTK520處于同一分支且同源性達到100%。

圖2 基于16SrDNA基因構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene

2.2.4 多位點序列分型(MLST) 以分離株C1-6的DNA為模板,對其七個管家基因進行PCR擴增,獲得七個300 bp左右長度的擴增產物(圖3),單個管家基因擴增后測序所得序列經blast比對后均與之前的16S rDNA基因比對結果一致。將七個管家基因序列依次拼接起來,長度約為2100 bp,經Blast比對后構建系統發育樹(圖4)。結果表明,MLST分型結果與16S rDNA同源性分析結果一致,但基于MLST分型方法構建的系統發育樹更能夠反映出分離株C1-6與所選參考菌株之間進化距離的差異,同時通過發育樹可以看出,菌株C1-6與C.butyricumCDC51208被更進一步分成同一小支,親緣關系為100%,而與同源性較高的ClostridiumbutyricumTK520存在系統發育上的差異。

圖3 等位基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of allele amplification products注:M:D2000;1～7:等位基因1～7。

圖4 基于七個等位基因構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on seven alleles

2.3 丁酸梭菌C1-6的生物學性質

2.3.1 生長曲線、pH曲線及丁酸生成量 將菌株C1-6接種于RCM液體培養基中于37 ℃下培養24 h,以培養時間為橫坐標,OD600、pH和丁酸生成量為縱坐標繪制生長曲線(圖5)和丁酸生成量曲線(圖6)。由圖5～圖6可知,菌株C1-6在0～4 h為生長遲滯期,4 h后進入對數生長期,12 h后進入穩定期,表明C1-6的生長速度較快。到達穩定期后,其OD600基本保持不變,最終穩定在1.7左右。丁酸梭菌在發酵過程中,產生大量丁酸、少量乳酸和乙酸等脂肪酸而使pH有所降低。處于生長期的菌株與處于遲滯期的相比,生長更加旺盛,因此,處于生長期的菌株pH變化量更大,而步入穩定期后菌株的生長逐漸穩定,代謝產物變化量不大,從而導致pH也趨于穩定,最終穩定在4.6左右。丁酸生成量曲線的走向與其生長曲線大致相同,其在4～8 h時丁酸變化量最大,約為1 g/L左右,其生成量最終穩定在2.1 g/L左右。

圖5 丁酸梭菌C1-6的生長曲線和pH曲線Fig.5 Growth curve and pH curve of C1-6

圖6 丁酸梭菌C1-6的丁酸生成量曲線Fig.6 Butyric acid production curve of C1-6

2.3.2 耐受性

2.3.2.1 酸耐受性 由圖7可知,丁酸梭菌C1-6在pH2和pH3的條件下,其活菌數隨孵育時間的延長逐漸下降。在pH2的條件下孵育1和3 h后,C1-6的存活率顯著降低(P<0.05),分別為83.3%和72.5%。在pH3的條件下,當孵育1 h時,其活菌數與孵育初始時相比沒有顯著變化(P>0.05),當孵育3 h后,其存活率顯著降低到91.8%(P<0.05),酸性越強對丁酸梭菌的的脅迫就越大。SchoNherr等[31]研究發現有8株丁酸梭菌在pH3的酸性條件下,表現為不生長或生長較弱。由此可知,本試驗菌株C1-6具有更好的酸耐受性。

圖7 丁酸梭菌C1-6在不同酸性條件下的存活率Fig.7 Survival rate of C1-6 under different acidic conditions注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8、圖9同。

2.3.2.2 膽鹽耐受性 當丁酸梭菌C1-6在不同膽鹽濃度條件下孵育3 h后,發現其存活率隨膽鹽濃度升高而增大,但在0.3%和0.5%的膽鹽濃度下的存活率差異不顯著(P>0.05)。當膽鹽濃度為1%時,其存活率與0.3%和0.5%膽鹽處理組相比顯著增加(P<0.05),最終存活率為104.63%,但在1%的膽鹽條件下的存活率與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)。以上結果表明,該菌具有較強的膽鹽耐受性,而且一定濃度的膽鹽溶液不但沒有明顯抑制其生長,反而對其生長具有促進作用(圖8)。這可能是因為膽鹽能夠促進丁酸梭菌芽孢的形成,反而提高其抗脅迫能力。但劉磊等[32]研究發現,丁酸梭菌CBM01在0.4%以下的膽鹽濃度中可以生長,在0.5%的膽鹽溶液中卻生長較差,這可能是由于菌株的膽鹽耐受性還與其細胞表層蛋白、細胞膜脂肪酸以及分泌的膽鹽水解酶種類等有關,而不單單與芽孢的存在相關,因此不同菌株之間會存在一定的膽鹽耐受差異性。

圖8 C1-6在不同膽鹽濃度條件下的存活率Fig.8 Survival rate of C1-6 under different bile salt concentrations

2.3.2.3 對模擬消化道環境的耐受性 在人體消化道中不僅存在酸和膽鹽,還存在各種消化酶,因此,益生菌通過連續模擬消化道試驗能夠更好地反映菌株對腸道環境的耐受性。為了研究丁酸梭菌C1-6對模擬消化道環境的耐受性,將其依次經過模擬唾液5 min、胃液2 h以及腸液2 h的處理后,存活率分別為98.44%、94.81%和93.06%。雖然存活率略有下降,但最終仍能保持在93%左右,表明該菌株對模擬消化道環境具有較強的耐受性。其中模擬唾液對菌株存活率的影響最小,模擬胃液對存活率的影響最大,而且顯著高于模擬唾液和腸液對菌株存活率的影響(P<0.05)(圖9)。與單純的酸性環境相比,C1-6在模擬消化道環境中的存活率更高,這可能是因為胃蛋白酶使酸性條件的極化程度變得不明顯,從而削弱了酸對菌體細胞的迫害[33]。而因為酸脅迫對C1-6的影響更明顯,導致其在胃液中的存活率下降明顯高于腸液。雖然本試驗僅模擬了酸、膽鹽以及消化酶對菌株的影響,沒有考慮其他影響因素,但對于具有良好耐受性益生菌的篩選仍具有借鑒意義。

圖9 丁酸梭菌C1-6歷經模擬消化道環境后的存活率Fig.9 Survival rate of C1-6 after simulated digestive tract environment

2.3.3.4 丁酸梭菌對抗生素的抗性 本試驗檢測了丁酸梭菌C1-6對10種抗生素的敏感性,并將S.aureusATCC25923作為質控菌株,質控范圍依據NCCLS藥敏試驗標準執行。試驗結果表明:該菌對青霉素、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、克林霉素具有抗性,對紅霉素中度敏感,對氨芐西林、四環素、萬古霉素、頭孢呋辛敏感(表3)。

表3 丁酸梭菌C1-6對幾種抗生素的抗性Table 3 Resistance of Clostridium butyricum C1-6 to several antibiotics

Isa等[34]評估了ClostridiumbutyricumMIYAIRI 588和C.butyricumATCC 19398T的抗生素抗性,發現其均對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素等氨基糖苷類抗生素具有抗性,而對人類和動物治療中其他重要的抗生素類別都非常敏感。王騰浩等[14]研究發現,C.butyricumZJU-F1除對氧氟沙星和克林霉素呈中度敏感外,對大多數氨基糖苷類抗生素均具有抗性,此外,對大多數青霉素類、四環素類以及頭孢類抗生素均具有敏感性。謝樹貴等[12]的研究表明,C.butyricumB1對慶大霉素和卡那霉素具有抗性。同樣地,本研究篩選得到的C.butyricumC1-6也對慶大霉素等氨基糖苷類抗生素具有抗性。由此表明,大多數丁酸梭菌對氨基糖苷類抗生素都呈現抗性,這可能是因為這類抗生素不能透過它們的微生物細胞膜[35],這是一種物理性的內在特征,而不是遺傳或代謝特性。與前人研究不同的是,C1-6表現出對青霉素的耐藥性,但這種抗性基因是否具有轉移的風險還有待進一步研究。

3 結論

本試驗從健康成人新鮮糞便中,通過選擇性培養基篩選得到一株丁酸產量較高的丁酸梭菌,其在RCM液體培養基中丁酸的產量可達2.1 g/L左右,并從形態學、生理生化特征、16S rDNA序列同源性以及多位點序列分型(MLST)等方面將其確定為丁酸梭菌,命名為C1-6。

本試驗篩選得到的丁酸梭菌C1-6在pH2和pH3的酸性條件下孵育3 h后存活率分別為72.5%和91.8%。在1%的膽鹽溶液中培養3 h后存活率與空白對照組相比沒有顯著變化(P>0.05),但顯著高于0.3%和0.5%的膽鹽溶液處理組(P<0.05)。歷經模擬唾液、胃液、腸液的連續模擬消化道環境后其存活率分別為98.44%、94.81%和93.06%。由此說明,丁酸梭菌C1-6具有較強的耐酸、耐膽鹽以及耐受模擬腸道環境能力。同時由于在酸性條件下丁酸梭菌的終產物丁酸會進一步抑制其自身的生長[36],從而導致與膽鹽脅迫相比,酸脅迫對丁酸梭菌的影響更大。抗生素抗性試驗結果表明,菌株C1-6對青霉素具有耐藥性,需進一步評價其耐藥基因的轉移風險。以上初步研究結果表明丁酸梭菌C1-6具有潛在的應用價值,但在使用之前應更全面地評估該菌株的安全性和益生功能。