4株抗致病菌Canidia albicans YTS03的潛在工程酵母菌抗性及其抗菌能力

譚春明,王 麟,趙 旺,吳開暢,溫為庚,陳 旭,于 剛,*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,熱帶水產研究開發中心,海南三亞 572018;2.農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室,廣東廣州 510300;3.北京航空航天大學青島研究院,北航歌爾微電子研究院,山東青島 266041)

條件致病菌是指在正常情況下并不致病,但在某些特殊條件下(如環境因子發生改變或宿主免疫防御機制受到損害)便可以致病的一些細菌或真菌。例如給人類身體健康帶來危害的白色假絲酵母,常導致婦科疾病及傷口感染。嗜殺酵母(Killer yeast)是指在其生長繁殖過程中能夠向體外分泌蛋白或者糖蛋白毒素,對某些微生物產生致命性作用的一類酵母。嗜殺酵母所產的嗜殺因子(或嗜殺毒素)能夠抑制或殺死某些特定的微生物,而這種嗜殺因子對酵母本身卻沒有嗜殺作用。嗜殺酵母所分泌的嗜殺因子多為蛋白質或糖蛋白,對動物或人體是安全、無毒、無害的。居于這一獨特的生物學特性,嗜殺酵母常作為工業生產菌株而被廣泛運用于發酵、食品、農業、養殖、醫藥等領域[1-2]。嗜殺酵母在發酵當中可以凈化發酵體系和環境,提高發酵產品的質量,提高生物穩定性[3-4];在食品工業,可抑制野生酵母的污染[5];在養殖業,一些海洋嗜殺酵母可以控制某些海洋酵母菌引起的海洋動物疾病[6]。同時,嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可抵制病原酵母及其類酵母等微生物,可作為潛在的抗真菌藥物[7]。目前,國內外許多種類的嗜殺酵母被發現和表征,并被指出具有巨大的應用潛力,但大部分因性質不穩定、抗逆性差而無法進行工業化利用[8]。

本研究室經過實驗得到4株能有效控制致病真菌CanidiaalbicansYTS-03且嗜殺活性強的海洋酵母,這些菌株在24 ℃下培養2～3 d其嗜殺因子產量達最大值,嗜殺作用的適合條件是溫度范圍0～40 ℃和pH范圍3.0～7.0,并且培養基中NaCl濃度對嗜殺活性影響明顯,鹽度具有增強活性的作用[9-11]。這些條件,使之具有作為工程菌的潛力,可以運用于控制人類及動植物中病原酵母菌的生長。然而,嗜殺酵母的抗逆性和抗菌能力直接關系到是否可作為工程酵母菌。為此對這4株海洋酵母進行了耐鹽、耐酸堿、耐高溫等抗逆性及抗菌能力研究,以期篩選出適應范圍廣、作用明顯且抗逆性強的嗜殺菌株,為該菌株的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜殺酵母菌株MetschnikowiasaccharicolaDD21-2(GenBank登入號:KY849584)、WickerhamomycesanomalusPA1(GenBank登入號:KY849582)、KluyveromycessiamensisSY3-1A(GenBank登入號:KY928421)和CyberlindneramrakiiWM1(GenBank登入號:KY849583) 均分離篩選于本實驗室,菌株DD21-2分離自丹東的海泥,SY3-1A分離自三亞紅樹林沉積物,而WM1和PA1分離自渤海灣沉積物,用17.5%的甘油溶液保存于-80 ℃冰箱;人類條件致病菌CanidiaalbicansYTS-03 由山東省煙臺市煙臺山醫院婦科提供,分離自陰道內分泌物樣品;YPD培養基和嗜殺活性檢測培養基 原料購買于北京索萊寶科技有限公司并按文獻[12]進行配制;抗生素 均購買于Sigma公司;產嗜殺因子培養基 酵母粉(1.0%,w/v)、葡萄糖(2.0%,w/v)、蛋白胨(2.0%,w/v)、NaCl(2.0%,w/v)、甘油(15.0%,v/v),用50 mmol/L的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液調節pH5.0,待成分溶解后于115 ℃ 滅菌 30 min;實驗所用試劑均為分析純。

SHP-250 型生化培養箱 上海博迅實業有限公司;?，擰YC-211 型搖床 上海知楚儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器有限公司;UV752 型紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜殺酵母菌的活化 挑取保存于-80 ℃冰箱的菌株接種于固體培養基上,28 ℃培養2 d,再取生長好的單菌落接種于YPD液體培養基中,28 ℃、140 r/min振蕩培養24 h。

1.2.2 嗜殺酵母菌抗逆性的測定

1.2.2.1 生長溫度對嗜殺酵母生長的影響 將活化后的4種供試菌株分別接種50 μL于300 mLYPD液體培養基中,分別在4、12、20、24、28、37、45 ℃下進行培養2～3 d。測定酵母菌數量,每個處理均重復3次,對照組為接種后未經培養的培養液。

1.2.2.2 pH對嗜殺酵母生長的影響 用50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液分別調節YPD液體培養基pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0(NaOH調節),將活化后的4種供試菌株分別接種50 μL于300 mL培養基中,置于24 ℃培養箱中培養2～3 d,測定酵母菌數量,每個處理均重復3次,對照組為接種后未經培養的培養液。

1.2.2.3 鹽濃度對嗜殺酵母生長的影響 將活化后的4種供試菌株分別接種50 μL于300 mL含有不同NaCl濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%)的YPD培養基中,置于24 ℃培養箱中培養2～3 d,測定酵母菌數量,每個處理均重復3次,對照組為接種后未經培養的培養液。

1.2.2.4 抗生素對嗜殺酵母生長的影響 選取放線菌酮、制霉菌素、氟康唑、酮康唑和伊曲康唑5種抗生素,每種抗生素5個濃度,分別為5、50、100、150和300 μg/mL。將配制好的各濃度抗生素溶液分別加入到高溫滅菌后的YPD培養基中,制成平板,然后將活化后的供試菌株進行劃線接種[13]。陽性對照為培養基不含抗生素的YPD劃線平板,置于24 ℃培養箱中培養觀察3～4 d,生長記為“+”,不生長記為“-”,每個處理均重復3次。

1.2.3 嗜殺酵母菌抗菌性檢測 為了進一步驗證其抗菌譜,選擇本實驗室菌種資源庫保藏的白假絲酵母(Candidaalbicans)、二尖梅奇酵母(Metschnikowiabicuspidata)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)、新型假絲酵母(Candidanivariensis)(尿路感染有關)、釀酒酵母(Sacchromycescerevisiae)、大隱求酵母(Cryptococcusmagnus)、阿薩絲孢酵母(Trichosporonasahii)、奧默柯達酵母(Kodamaeaohmeri)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、金黃色隱球酵母(Cryptococcusaureus)、長孢洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)和地霉屬(Geotrichumsp.)作為敏感菌株進行檢測。將敏感菌株自斜面接種于YPD 液體培養基中振蕩培養24 h(24 ℃,140 r/min),取2.0 mL菌液5000×g離心5 min,棄上清,菌體用無菌水洗滌3次并懸浮,敏感菌株的細胞量調節至107～108cells/mL。使用前搖勻菌懸液,用滅菌的棉簽沾上并涂布于嗜殺活性檢測培養基平板上,靜置5～10 min,然后用鑷子取無菌的濾紙片(直徑0.6 cm)在嗜殺酵母菌液中浸泡后放置于平板上,靜置2 min,取下濾紙片,將平板移至24 ℃的培養箱中培養2～3 d,用尺子分別量取抑菌圈和濾紙片上菌落的直徑并記錄[12]。

1.2.4 嗜殺因子嗜殺活性檢測 將4株供試菌接種50 μL于300 mL產嗜殺因子培養基當中,24 ℃、140 r/min下培養3 d,用0.45 μm濾膜過濾獲得嗜殺因子清液。按1.2.3的方法制備病原菌YTS-03的菌懸液,使用前搖勻,用滅菌的棉簽沾上并涂布于嗜殺活性檢測培養基平板上,靜置5～10 min,然后按照實驗要求將滅菌的牛津杯(Oxford-cups,6.0 mm×10.0 mm)放置于平板上,取250.0 μL的嗜殺因子清液加入到牛津杯中,將平板移至24 ℃的培養箱中培養2～3 d,用尺子量取抑菌圈的直徑并記錄[12,15]。

1.2.5 酵母數量的測定 采用比濁法,根據菌懸液的濃度在一定范圍內與光密度成正比,可以用分光光度計測600 nm波長處的OD值,用OD值作為待測菌株菌液濃度指標,其菌液濃度由標準曲線獲得[9,14]。取樣液按10倍梯度稀釋成不同濃度,測定其OD值并采用平板計數法獲取相對應濃度的細胞數量,以菌液濃度為橫坐標(X),不同濃度發酵液OD600 nm值為縱坐標(Y)繪制標準曲線,標準曲線的方程為Y=0.6677X+0.0202,R2=0.9998。不同發酵水平的菌液濃度便可通過測定OD600 nm,由標準曲線得到,ΔX=X培養后-X培養前。

1.3 數據處理

實驗數據采用Mean±SD表達,統計分析利用SPSS 21.0進行,方差分析(ANOVA)和Duncan法比較均值間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 生長溫度對嗜殺酵母菌生長的影響

據文獻[16-17]報道,大多數嗜殺酵母菌的最適生長溫度為20～28 ℃,并且多數海洋嗜殺酵母菌能夠在5 ℃時生長,只有極少部分菌株能夠在47 ℃下生長。從表1可以看出,溫度對這4株嗜殺酵母菌株均存在顯著影響(P<0.05),且菌株對溫度的適應范圍較寬,都可以在12～37 ℃環境中生長,PA1菌株在4 ℃下仍有繁殖能力,但供試菌在45 ℃下培養都不能生長,表現出較強的耐熱性和很寬的溫度適應范圍。嗜殺酵母群落因所處的地理位置、土壤類型、水環境、污染程度和生物因素不同而呈現出多樣性[18-22]。許多研究結果表明,嗜殺酵母的生長和繁殖受諸多因素的影響,如培養基組成、溫度、pH及鹽度等。其中,溫度對嗜殺酵母生長繁殖的影響主要表現在酶活性、細胞膜流動性及物質的溶解度三方面[4,8]。

表1 不同溫度對嗜殺酵母菌株生長的影響Table 1 Effects of temperature on growth of the killer yeast

2.2 不同pH對嗜殺酵母菌生長的影響

嗜殺酵母菌在生長繁殖過程中對pH的適應范圍較寬,但不同pH對所產嗜殺因子的活性及穩定性會產生較大影響[4]。從表2結果可以看出,酸堿度對這4株嗜殺酵母菌株的生長影響顯著(P<0.05),生長繁殖的pH范圍為3～9,其中PA1和SY3-1A菌株在pH為9的環境下仍能正常繁殖,而DD21-2和WM1菌株的生長受到較大限制,當pH增至10時這四株嗜殺酵母均不生長。表明,這4株嗜殺酵母同樣具有較強的耐酸堿性,在生長繁殖過程中能夠抵抗環境pH變化帶來的影響。環境pH對酵母菌的影響主要體現在酶活性、細胞膜的通透性、膜表面電荷和離子化程度。研究指出,嗜殺酵母菌生長繁殖的pH范圍為3～8,其分泌的嗜殺因子的活性在偏酸性環境下較為穩定[8,23]。

表2 不同pH對嗜殺酵母菌株生長的影響Table 2 Effects of pH on growth of the killer yeast

2.3 不同鹽濃度對嗜殺酵母菌生長的影響

從表3可以看出,這4株供試菌株都具有較強的耐鹽特性,其中SY3-1A和PA1菌株分別能夠在8%和9%的鹽度下正常生長,DD21-2菌株可以在7%的鹽度下正常繁殖,而WM1菌株卻在4%的鹽度下生長受到較大限制。鹽度對各菌株的生長均有顯著影響(P<0.05)?？梢?嗜殺酵母菌株都能適應高鹽度的生長環境但耐鹽能力有較大的差異,呈現明顯的多樣性。這可能是海尼和海灣沉積物長期被海水浸泡,從此生態環境中獲得的嗜殺酵母具有較強的抗鹽性。而鹽度對嗜殺酵母生長的影響主要是影響滲透壓和細胞膜的通透性,同時影響其所分泌的嗜殺因子的嗜殺活性。許多研究指出,有些酵母的嗜殺因子在無NaCl存在的情況下沒有嗜殺活性,如漢遜酵母Hansenulaanomala,并且該菌株在一定范圍內嗜殺活性隨著NaCl濃度的增加而增加[24]。酵母菌株Pichiamembranifaciens所產生的嗜殺因子其活性與NaCl是否存在有關,但嗜殺酵母的生長卻與NaCl是否存在無關[25]。嗜殺酵母對鹽度的耐受性存在差異性,耐鹽性嗜殺酵母常在發酵領域有較大的作用。

表3 不同鹽度對嗜殺酵母菌株生長的影響Table 3 Effects of salinity on growth of the killer yeast

2.4 嗜殺酵母菌對抗生素的抗性

對所獲得的4株潛在工程酵母菌株進行耐藥性的測定,結果見表4,可以看出嗜殺酵母菌對抗菌素較為敏感。其中,PA1菌株對放線菌酮、氟康唑和酮康唑幾乎無抗性,對5 μg/mL制霉菌素和300 μg/mL的伊曲康唑仍有抗性;而DD21-2菌株除酮康唑外對其它4種抗菌素均有抗性,不過這種抗性只體現在較低濃度的抗菌素;SY3-1A菌株同樣對放線菌酮、酮康唑和氟康唑無抗性,僅對伊曲康唑和5 μg/mL制霉菌素有抗性;WM1菌株對5 μg/mL的制霉菌素和氟康唑有抗性,對伊曲康唑呈現出強抗性。可見,這4株嗜殺酵母對抗生素敏感,容易被抗生素所抑制。

表4 抗生素對嗜殺酵母菌株生長的影響Table 4 Effects of antibiotics on growth of the killer yeast

2.5 嗜殺酵母菌抗菌譜的檢測

由表5可知,這4株供試菌均有較寬的殺菌譜,除對人類條件致病菌Candidaalbicans有強嗜殺活性外,還對梭子蟹“乳化病”病原菌Metschnikowiabicuspidata和人類條件致病菌Candidatropicalis有很強的嗜殺活性,其抑菌圈直徑和菌落直徑的比例大于2.5。另外,PA1和WM1菌株還能殺死解脂耶羅維亞酵母、金黃色隱球酵母和地霉屬,而且PA1對釀酒酵母和長孢洛德酵母也有抑制作用,WM1對光滑假絲酵母有抑制作用。DD21-2菌株和PA1菌株具有相似的殺菌譜,但能殺死近平滑假絲酵母卻對解脂耶羅維亞酵母和地霉屬無作用。而SY3-1A菌株除對白色假絲酵母、二尖梅奇酵母和熱帶假絲酵母有較強嗜殺活性外,還對長孢洛德酵母和膠紅酵母有嗜殺活性。這4株嗜殺酵母在殺菌譜方面表現出差異性和特異性。

表5 嗜殺酵母殺菌譜的檢測Table 5 The killing activity spectra of the killer yeast

據文獻報道,嗜殺酵母菌株Komagataellaphaffii的嗜殺因子同樣有很寬的抗菌范圍,在釀造條件下能同時殺死Kloeckera和Hansenula菌屬,被認為可作葡萄酒工業中潛在的抗真菌劑[26]。Wang等[27]也指出,嗜殺酵母菌株WilliopsissaturnusWC91-2和PichiaanomalaYF07b具有較寬的殺菌譜,都能夠作用于膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)等其它6種類型的酵母菌。然而,有些嗜殺酵母菌,只對某種特定的病原酵母起作用。例如,Buzdar等[28]所研究的KluyveromycessiamensisHN12-1菌株,只能殺死致病酵母MetschnikowiabicuspidataWCY,而對其他酵母菌株無嗜殺作用。不同的嗜殺酵母菌株表現出不同嗜殺系統和嗜殺特性,對特殊致病菌有嗜殺活性的酵母菌株,其產生的嗜殺因子能運用于自然環境和醫藥領域[29-32]。

2.6 嗜殺因子的嗜殺活性

從圖1可以看出,嗜殺因子作用于敏感菌株YTS-03之后,檢測平板上的牛津杯周圍均產生了非常明顯的抑菌圈,說明這4株潛在工程酵母菌的嗜殺因子對C.albicansYTS-03具有較高的嗜殺活性。PA1、DD21-2、SY3-1A和WM1的菌液抑菌圈直徑分別達到23.0、14.1、22.3和21.5 mm。嗜殺酵母的嗜殺因子表現出不同的嗜殺活力,跟菌株的多樣性和特異性有關,同種屬的菌株都具有不同的嗜殺能力,如郭風君測得的海洋嗜殺酵母WickerhamomycesanomalusYF07b菌株抑菌圈直徑小于本研究中的PA1菌株[33]。

圖1 嗜殺酵母菌株嗜殺因子的抑菌照片Fig.1 Killer activity of the killer yeast strains

3 結論

從不同地區獲得的這4株嗜殺酵母菌株,無論是在耐高溫性、耐酸堿性,還是在耐鹽性方面,都表現出較強的抗性。對溫度和環境pH的適用范圍較寬,都可以在12～37 ℃及pH3～9的條件下生長繁殖,而且均能夠在高鹽度下正常生長,生長性能上具有一定的工程菌潛力。通過耐藥性實驗表明,嗜殺酵母菌對抗菌素較為敏感,但對伊曲康唑和低濃度(5 μg/mL)的制霉菌素或低濃度(5 μg/mL)的氟康唑有抗性,并且不同嗜殺酵母菌株具有不同的抗藥性特征,對抗生素的敏感性存在差異。而在殺菌譜方面,這4株供試菌均能殺死白色假絲酵母、二尖梅奇酵母和熱帶假絲酵母,而且嗜殺活力很高,并表現出差異性和特異性。PA1和WM1菌株還能殺死解脂耶羅維亞酵母、金黃色隱球酵母和地霉屬;而且PA1對釀酒酵母和長孢洛德酵母也有抑制作用,WM1對光滑假絲酵母有抑制作用,DD21-2能殺死近平滑假絲酵母,SY3-1A對長孢洛德酵母和膠紅酵母有嗜殺活性。嗜殺因子活性的測定表明,這4株潛在工程酵母菌的嗜殺因子對C.albicansYTS-03具有較高的嗜殺活性,菌株PA1、DD21-2、SY3-1A和WM1的菌液抑菌圈直徑分別達到23.0、14.1、22.3和21.5 mm。從以上指標可以看出,這4株嗜殺酵母具有作為工程酵母菌的潛力,使開發抗真菌生物制劑成為可能。

如果能大規模獲得這種嗜殺因子并作為抗真菌藥制劑來治療白色念珠菌引發的疾病,將會帶來巨大的社會效益和經濟效益。為解決當前大多抗真菌類藥物價格昂貴、不安全和引起敏感菌抗藥性增強等問題提供新手段。這4種適應范圍廣、作用明顯且抗逆性強的嗜殺菌株,也為進一步采用生物技術改造菌株提供原材料。