木聚糖酶重組畢赤酵母合成培養基的PlackettBurman法優化

朱新術,趙文慧,張曉蕾,林 波,劉 超,張 苗,陳 菲

(1.江蘇護理職業學院醫學技術學院,江蘇淮安 223005;2.江蘇護理職業學院醫學基礎部,江蘇淮安 223005)

木聚糖酶是一類能夠特異降解木聚糖的酶類,在造紙、動物飼料、廢水處理和食品工業等領域都有重要應用[1-3]。在食品工業領域,主要用于改善面包品質、澄清果汁、液化蔬果。酶解產物木寡糖還能以益生元的形式作為食品添加劑使用[3],例如添加木聚糖酶酶解黑小麥不溶性膳食纖維的酶解產物,可對谷物擠壓膨化產品品質提升具有較好的改善作用[4]。

木聚糖酶已在畢赤酵母GS115中實現高效表達[5-6],但是其常用的BMGY和BMMY等復合培養基含有昂貴的酵母粉和蛋白胨,成分復雜且不明確,目標蛋白純化困難,不利于產業類似化生產[6]。當前重組畢赤酵母最常用的合成培養基是基礎鹽培養基BSM。FM22是在BSM基礎上改進后的另一種常用合成培養基,具有氮源豐富、適應性強[7]、縮短發酵延遲期和發酵時間等優點[8]。當pH高于5.5時,BSM和FM22培養基就會出現乳白色渾濁,特別是添加微量元素溶液PTM1/PTM4[7-8]時,沉淀增加明顯,原因是形成了不溶性的銅、鈷、亞鐵、鋅等磷酸鹽,而大部分畢赤酵母重組蛋白的發酵過程中pH在5.5和7.0之間變化[9]。發酵過程大量生成金屬鹽類沉淀會嚴重阻礙細胞生長及增加下游蛋白分離純化的難度[9-11]。Zhang等研究表明,甘油磷酸鈉可以代替BSM和FM22培養基中的磷酸/磷酸鹽,作為高效的磷源用于較高pH情況下細胞的生長和外源蛋白的表達(新型培養基命名為FMG)[11-13]。

本文首先通過單因素實驗與t檢驗[14]分析重組畢赤酵母在多種培養基中的生物量、酶活力與比酶活,并確定FMG為最適初始培養基。然后通過Plackett-Burman試驗[14-15]和逐步回歸[16-17],篩選出影響重組畢赤酵母表達木聚糖酶酶活力誘導培養基的關鍵培養基成分,并利用皮爾遜相關性分析[18],對非關鍵培養基成分高低濃度做出合理取舍,從而為進一步的優化分析提供實踐基礎與理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET-28a-xynZF-2重組載體 由新鄉醫學院微生物實驗室饋贈;畢赤酵母(Pichiapastoris)、GS115、pPIC9K表達質粒 購自Invitrogen公司;樺木木聚糖(Birch wood xylan) 分析純,Sigma公司;酵母粉 分析純,英國OXOID公司;蛋白胨 分析純,美國BD公司;甘油磷酸鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;甘油和甲醇 均為分析純,天津市德恩化學試劑有限公司;其他試劑 均為市售國產或進口分析純級。

HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;DC-0506低溫恒溫槽 上海比朗儀器有限公司;Neofuge 23R高速離心機 上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 YPD種子培養基:酵母粉10.0 g/L,蛋白胨20.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,瓊脂20.0 g/L。搖瓶生長培養基和誘導培養基:見表1所示。其中PTM1微量元素溶液配方[8]:CuSO4·5H2O 6.0 g,NaI 0.08 g,MnSO4·H2O 3.0 g,Na2MoO4·2H2O 0.2 g,H3BO30.02 g,CoCl20.5 g,ZnCl220.0 g,FeSO4·7H2O 65.0 g,Biotin 0.2 g,H2SO45.0 mL和蒸餾水 1000 mL。PTM4微量元素溶液配方[5]:CuSO4·5H2O 2.0 g,NaI 0.08 g,MnSO4·H2O 3.0 g,Na2MoO4·2H2O 0.2 g,H3BO30.02 g,CaSO4·2H2O 0.5 g,CoCl20.5 g,ZnCl27.0 g,FeSO4·7H2O 22.0 g,Biotin 0.2 g,H2SO41.0 mL和蒸餾水1000 mL。

表1 搖瓶生長和誘導合成培養基成分Table 1 Components of flask shaking growth and induced medium

1.2.2 菌種活化培養 將-80 ℃凍存的表達木聚糖酶的畢赤酵母甘油管劃線接種到YPD活化平板培養基[6]中,30 ℃靜置培養3 d。

1.2.3 種子搖瓶培養 從菌種活化平板中挑取生長良好的單菌落接種到裝有25 mL YPD種子培養基的250 mL三角瓶中,30 ℃、250 r/min培養20 h。

1.2.4 搖瓶生長發酵 將種子液按4%(V/V)的接種量接入裝有25 mL搖瓶生長培養基的250 mL三角瓶中,30 ℃、250 r/min培養24 h。

1.2.5 搖瓶誘導發酵 將搖瓶生長培養基培養24 h所得發酵液置于50 mL無菌離心管中,室溫,5000 r/min離心5.0 min,去上清,菌體用0.01 mmoL/L pH6.0的無菌PBS緩沖液洗滌三次并重懸,然后接種到裝有25 mL搖瓶誘導培養基的250 mL三角瓶中,加入0.22 μm濾膜過濾的微量元素溶液,每24 h按0.5%(V/V)的比例加入甲醇誘導培養,30 ℃、250 r/min培養5 d,并取樣分析。

1.2.6 測試方法

1.2.6.1 生物量檢測 細胞濃度(OD600):發酵液經適當稀釋后于波長600 nm可見光波長下測定吸光度[10]。OD600=600 nm吸光度值×n(n為稀釋倍數)。且1 OD600=0.371 g/LDCW(細胞干重)。

1.2.6.2 木聚糖酶酶活力測定 采用改進的DNS法[19-20]測定木聚糖酶酶活力(U/mL)。酶活力單位的定義:在45 ℃和pH4.6條件下,以0.5%樺木木聚糖作為底物,以每分鐘產生1 μmol木糖所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.6.3 木聚糖酶比酶活分析 用Bradford法[21-22]測定蛋白質濃度(mg/mL),以牛血清白蛋白作為標準蛋白。木聚糖酶的比活用下式計算:

酶的比活性(U/mg)=酶活力(U/mL)/蛋白質質量(mg/mL)

1.2.7 試驗設計

1.2.7.1 最適初始誘導培養基的單因素篩選 單因素實驗逐次比較重組畢赤酵母在BSM誘導培養基(PTM1)與FM22誘導培養基Ⅰ(PTM1)、FM22誘導培養基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導培養基Ⅱ(PTM4)、FM22誘導培養基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導培養基Ⅲ(PTM1+吐溫80)以及FM22誘導培養基Ⅲ(PTM1+吐溫80)與FMG誘導培養基(PTM1+吐溫80)培養基中生物量、木聚糖酶酶活力與比酶活,并以酶活力為主要指標,通過t檢驗等統計學方法篩選最適初始培養基。

1.2.7.2 Plackett-Burman試驗設計 在篩選出最適初始誘導培養基FMG誘導培養基Ⅲ(PTM1)+吐溫80的基礎上,利用MATLAB v8.3軟件包統計學工具箱中的hadamard函數實施N=12的Plackett-Burman實驗設計,即對FMG誘導培養基中的7個成分(甘油磷酸鈉、(NH4)2SO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O、PTM1和甲醇)實施高和低二水平的實驗研究,其中高水平用“+1”表示,低水平用“-1”表示,水平設置狀況依據是根據單因素實驗結果。實驗設計因素水平及編碼見表2與表3(其中D1-D4列為空列,用于估計誤差),評價指標為畢赤酵母生物量、木聚糖酶酶活力及其比酶活。

表2 Plackett Burman試驗設計因素水平及編碼Table 2 Factors and levels as well as codes of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman試驗設計(n=3)Table 3 Design of Plackett-Burman design(n=3)

1.3 數據處理

所有配方均進行三個平行實驗,結果以均值±標準誤為準。篩選最適初始誘導培養基涉及的單因素t-檢驗利用MATLAB v8.3軟件包ttest函數實施;Plackett-Burman實驗中培養基成分和生物量、木聚糖酶酶活力及比酶活間的多元線性模型通過MATLAB v8.3軟件包逐步回歸函數stepwise實施;Plackett-Burman實驗中培養基成分與三個響應之間及三個響應之間的相關系數通過MATLAB v8.3軟件包corrcoef函數實施。

2 結果與分析

2.1 最適初始培養基的單因素篩選

2.1.1 BSM誘導培養基與FM22誘導培養基Ⅰ培養效果對比分析 重組畢赤酵母在兩種最常見合成培養基的木聚糖酶表達結果見圖1。FM22培養基產酶效果好于BSM培養基,表現在前者木聚糖酶酶活力和比酶活極顯著高于后者(P<0.01),而生物量在兩種培養基中沒有顯著差異(P>0.05),這可能與FM22培養基氮源豐富、適應性強[6]、發酵延遲期短等性狀有關,所以后續實驗使用FM22培養基。

圖1 BSM和FM22培養基對菌體生長和產木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of BSM and FM22 medium on cell growth and expression of xylanase注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01),且均為兩種培養基相同優化指標間的比較;圖2～圖4,同。

2.1.2 FM22誘導培養基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導培養基Ⅱ(PTM4)培養效果對比分析 FM22誘導培養基添加微量元素溶液PTM1/PTM4時木聚糖酶的表達結果見圖2。FM22培養基添加PTM1微量元素的產酶效果好于添加PTM4的結果,表現在前者的三種測定指標均優于后者(P=0.0367、0.0368和0.0318,均<0.05)。PTM1和PTM4包含Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Na+、Co+等金屬離子及生物素等,主要用于提供畢赤酵母生長和外源蛋白表達所需的各種微量元素[23]。PTM1與PTM4的最大區別是前者Fe2+、Zn2+含量明顯高于后者,這與文獻報道這兩種離子對BMMY培養基情況下木聚糖酶酶活力有激活作用相一致[6],所以后續實驗使用PTM1微量元素展開研究。

圖2 微量元素溶液PTM1和PTM4對菌體生長和產木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of PTM1 and PTM4 on cell growth and expression of xylanase

2.1.3 FM22誘導培養基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導培養基Ⅲ(PTM1+吐溫80)培養效果對比分析 FM22(PTM1)誘導培養基添加表面活性劑吐溫80對木聚糖酶的表達見圖3。FM22誘導培養基添加吐溫80的木聚糖酶酶活力顯著高于未添加(P=0.0123<0.05),但是生物量和比酶活沒有顯著差異(P>0.05),這應該與吐溫80等表面活性劑能夠改善細胞膜的通透性、提高酶的穩定性和催化能力有關聯[24-25]。所以在后續培養基中添加吐溫80進行研究。

圖3 吐溫80對菌體生長和產木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of Tween 80 on cell growth and expression of xylanase

2.1.4 FM22誘導培養基Ⅲ(PTM1+吐溫80)與FMG誘導培養基(PTM1+吐溫80)培養效果對比分析 FM22和FMG兩種誘導培養基的主要差別是FMG利用甘油磷酸鈉代替FM22中的KH2PO4[8](表1)。由圖4可知,重組畢赤酵母在FMG誘導培養基中木聚糖酶酶活力和比酶活極顯著高于FM22誘導培養基Ⅲ(P分別為3.81e-05和5.952e-04,均<0.01),且前者分別是后者的2.126倍和3.114倍,而生物量大小并沒有顯著差異(P>0.05)。這可能與FMG誘導培養基培養初始pH較高,及文獻報道的大部分畢赤酵母重組蛋白的發酵過程中pH在5.5和7.0之間變化有直接關系[11]。此外,也說明甘油磷酸鈉可以作為更好的磷源及緩沖劑用于重組畢赤酵母表達木聚糖酶研究。

圖4 FM22和FMG培養基對菌體生長和產木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of FM22 and FMG on cell growth and expression of xylanase

經過以上單因素分析,最終篩選出生物量、酶活力和比酶活分別為43.9、(752.4±43.4) U/mL和(2552.4±197.2) U/mg的FMG誘導培養基作為培養基優化的最適初始誘導培養基。

2.2 Plackett-Burman試驗結果分析

Plackett-Burman設計實驗結果見表4,可知酶活力與比酶活的最高值均由3號實驗(其培養基配方為甘油磷酸鈉 20 g/L,(NH4)2SO42g/L,CaSO4·2H2O 2 g/L,K2SO420 g/L,MgSO4·7H2O 6.0 g/L,PTM1 8.0 mL/L,甲醇10 mL/L,吐溫80 2.0 g/L)獲得,酶活力和酶比活分別為(2298.4±77.8) U/mL和(9926.3±312.2) U/mg,比優化前的(752.4±43.4) U/mL和(2552.4±197.2) U/mg(FMG誘導培養基),分別提高了2.055倍和2.889倍。

表4 Plackett-Burman設計實驗結果Table 4 Result of Plackett-Burman design

利用MATLAB v8.3軟件包逐步回歸函數stepwise建立培養基成分與生物量、木聚糖酶酶活力及比酶活的多元線性回歸模型(表5)。

表5 逐步回歸模型分析Table 5 Analysis of the stepwise regressions

由表5知,所得三個回歸模型均達到極顯著(P<0.01),修正后的決定系數R2分別為0.724、0.9727和0.9515。這表明木聚糖酶酶活力和比酶活的實驗值和預測值之間具有較好的擬合度,95%以上的實驗數據變異均可通過回歸模型來解釋。而回歸方程系數的顯著性檢驗表明,這兩種響應值均包含多個顯著因子,其中相同的極顯著因子為甘油磷酸鈉(A)、硫酸銨(B)、二水硫酸鈣(C)和PTM1(F)(P<0.01),且由其回歸系數的符號,進一步優化需要在高水平(+1)的基礎上提高甘油磷酸鈉和硫酸鈣的濃度,在低水平(-1)的基礎上降低硫酸銨和PTM1的含量,這與文獻報道相一致[7]。甲醇作為誘導培養階段的誘導劑和重要碳源及能量來源,對于比酶活有顯著作用(P<0.05)。但生物量的修正回歸系數則偏低,僅為0.724,這與其回歸模型顯著性系數偏少相關聯,也與前述篩選最適初始誘導培養基的單因素優化分析中生物量的差異總是不顯著有關。綜上所述,通過Plackett-Burman設計篩選的顯著因子作為進一步實驗的優化目標。

利用MATLAB軟件包的corrcoef函數分析培養基成分與響應及響應之間的相關系數r,結果如表6所示。可知相關系數的正負號大致與表5中回歸方程系數的正負號相同,僅酶活力與K2SO4(D)和MgSO4·7H2O(E)的正負號相反,但這兩種成分對酶活力影響均不顯著(P>0.05)。綜合考慮后,后續實驗將把它們的水平設置為中間值。此外,對于生物量來說,僅甘油(G)和甘油磷酸鈉(A)的相關系數絕對值較大(分別為0.838和0.291),而表5中僅有甘油(G)通過顯著性檢驗(P<0.01)。并且生物量與酶活力和比酶活的相關系數都很高,分別為0.597和0.309,所以后續實驗甲醇含量處于高水平(即10 mL/L)有利于提高木聚糖酶的酶活力和比酶活。

表6 Plackett-burman設計相關系數表Table 6 Correlation coefficients table of Plackett-Burman design

3 結論

本文通過單因素分析、Plackett-Burman實驗設計、基于逐步回歸的多元線性模型和相關系數分析,初步優化了重組畢赤酵母表達木聚糖酶的誘導合成培養基。通過單因素實驗發現甘油磷酸鈉、硫酸銨、硫酸鈣和PTM1是影響木聚糖酶表達的關鍵培養基成分其中甘油磷酸鈉是比KH2PO4更適于作為重組畢赤酵母表達木聚糖酶的磷源,并得到FMG誘導培養基是最佳初始誘導合成培養基;通過Plackett-Burman實驗得到誘導合成培養基的最佳配方為甘油磷酸鈉 20 g/L,(NH4)2SO42.0 g/L,CaSO4·2H2O 2.0 g/L,K2SO420.0 g/L,MgSO4·7H2O 6.0 g/L,PTM1 8.0 mL/L,甲醇10.0 mL/L,吐溫80 2.0 g/L。在此條件下木聚糖酶的酶活力和比酶活有了大幅度的提高,分別達到(2298.4±77.8) U/mL和(9926.3±312.2) U/mg。通過相關系數分析可以對非顯著成分的濃度取值做出合理取舍。該研究為進一步優化發酵培養基成分提供了重要的理論依據與實踐基礎。