超聲輔助酶法提取西番蓮果皮可溶性膳食纖維及理化性質

李 晗,楊宗玲,畢永雪,張 蕊,徐玉巧,范方宇,*

(1.西南林業大學林學院,云南昆明 650224;2.西南林業大學生命科學學院,云南昆明 650224)

西番蓮(Passifloraedulis)是我國重要的熱帶水果之一,果皮含量約為50%。目前,西番蓮主要用于果汁和飲料生產,果皮以丟棄為主,造成嚴重的資源浪費和環境污染[1]。而西番蓮果皮干燥后制成的粉碳水化合物含量較高,可作為膳食纖維或生物活性提取物的來源,用于食品、醫藥和化妝品行業[1]。西番蓮果皮粉(Passion Peel Flour,PPF)中可溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber,SDF)含量約為35%[1]。西番蓮果皮膳食纖維(PSDF)是一種低熱量化合物,被認為是健康飲食的重要組成部分,可用于降低血清膽固醇和血糖含量,對胃腸道功能調節、輔助治療心血管疾病和糖尿病有促進作用[2]。此外,PSDF在食品工業中也可廣泛用于改善產品質地或改善營養[3]。

目前,SDF的提取方法包括化學法、酶法、微生物發酵法和超聲波法等[4-5]。化學法操作簡單、成本低,但酸堿和高熱處理易破壞SDF結構;酶法條件溫和,操作方便,所得SDF質量較好,但提取條件嚴格,費用較高;發酵法制得的SDF純度較高,色澤、氣味、分散程度和持水力等均優于化學法,但技術尚未成熟;超聲波法提取SDF,可提高得率,縮短時間[4-5]。超聲波通過液體介質時,液體和溶解氣體的相互作用會產生聲空化現象,會影響碳水化合物聚合形態和結構[6]。近年來,超聲波技術由于其環保性,已廣泛應用于食品工業領域。Zhang等[6]、Bagherian等[7]、Chen等[8]在SDF的提取研究中均發現,超聲處理可有效提高SDF得率,并縮短提取時間。

基于此,研究采用超聲波預處理輔助酶法提取PSDF,以料液比、酶解溫度、超聲功率、混合酶量四個因素進行單因素實驗,結合正交實驗優化PSDF提取條件,并對其理化性質進行分析。以期為PSDF的提取提供新的技術參考,為西番蓮的綜合利用開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮 云南昆明;玉米油、豬油 重慶豐順冷凍副食品糧油有限公司;檸檬酸(分析純) 天津市風船化學試劑科技有限公司;α-淀粉酶(10000 U/g) 邢臺萬達生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(100000 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;95%乙醇 天津市致遠化學試劑有限公司;膽固醇(分析純) 上海患世生化試劑有限公司;鄰苯二甲醛(分析純) 上海源葉生物科技有限公司;鹽酸、硫酸、冰醋酸(分析純) 云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;SB25-12DTDS超聲波清洗器 寧波新藝超聲設備有限公司;CRT-400高速多功能粉碎機 永康市超然電器有限公司;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司;IKA RV10立式旋轉蒸發儀 南京榮華科學器材有限公司;5804R臺式冷凍離心機 德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 西番蓮果皮洗凈,60 ℃恒溫干燥箱內干燥48 h。干燥果皮于超微粉碎機中粉碎,過60目篩,取篩下樣品,得PPF,4 ℃環境密封保存備用。

1.2.2 粗PSDF提取工藝 稱取5 g PPF于燒杯中,加入適量0.2%檸檬酸溶液,40 ℃超聲提取30 min后取出,加入混合酶(α-淀粉酶∶木瓜蛋白酶=1∶1)酶解1 h,沸水浴滅酶10 min,冷卻后加入樣液體積的1/3的10%過氧化氫于45 ℃水浴脫色1 h,4000 r/min離心20 min,取上清液于50 ℃旋轉蒸發儀中濃縮至原體積的1/3,加入濃縮液4倍體積的預熱至60 ℃的95%乙醇,醇沉30 min,5000 r/min離心20 min,取沉淀50 ℃烘干,得到粗PSDF。得率以公式(1)計算。

PSDF得率(%)=(粗PSDF粉末質量/PPF質量)×100

式(1)

1.2.3 單因素實驗 固定條件為:料液比1∶20 g/mL、酶解溫度70 ℃、超聲功率300 W、混合酶量0.4%。分別研究料液比(1∶14、1∶17、1∶20、1∶23、1∶26 g/mL)、酶解溫度(50、60、70、80、90 ℃)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)、混合酶量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)對粗PSDF得率的影響。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗基礎上,以PSDF得率為評價指標,采用L9(34)正交試驗優化提取工藝。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 理化性質測定 對PPF和PSDF分別進行理化性質測定。

1.2.5.1 溶脹性測定 參照陳良云等[9]的方法進行測定。稱取0.500 g樣品于10 mL量杯中,加入7 mL蒸餾水,振蕩均勻,室溫靜置24 h,觀察樣品的自由膨脹體積。溶脹性以公式(2)計算。

溶脹性(mL/g)=(樣品膨脹體積-干樣品體積)/干樣品質量

式(2)

1.2.5.2 持水力測定 參照陳良云等[9]的方法進行測定。稱取0.500 g樣品于離心管中,加入7 mL蒸餾水,混勻,室溫靜置24 h,4000 r/min離心20 min,棄上清液,稱取剩余殘渣質量。持水力以公式(3)計算。

持水力(g/g)=(離心后樣品質量-離心前樣品質量)/干樣品質量

式(3)

1.2.5.3 堆積密度測定 參照Basanta等[10]的方法進行測定。稱取一定質量的樣品于10 mL量杯中,記錄體積。堆積密度以公式(4)計算。

堆積密度(g/cm3)=樣品質量/樣品體積

式(4)

1.2.5.4 脂肪結合力測定 參照陳良云等[9]的方法進行測定。分別取0.500 g樣品于10 mL離心管中,一個離心管加入10 g豬油(飽和脂肪酸結合力),另一個加入10 g玉米油(不飽和脂肪酸結合力),靜置1 h,4000 r/min離心20 min,棄上層油,稱重。脂肪結合力以公式(5)計算。

脂肪結合力(g/g)=(離心后樣品質量-離心前樣品質量)/干樣品質量

式(5)

1.2.5.5 膽固醇吸附力測定 采用鄰苯二甲醛法進行測定,參照齊慧等[11]的方法。

a.膽固醇標準曲線繪制:分別取0.3 mg/mL膽固醇標準溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL于比色管中,加入冰乙酸至0.8 mL,然后依次加入1 mg/mL鄰苯二甲醛0.4 mL及混合酸(濃硫酸∶冰乙酸=1∶1)8 mL,靜置15 min,于550 nm處測定各標準管吸光值。以吸光值為縱坐標(y),膽固醇含量(μg)為橫坐標(x)繪制標準曲線。得到膽固醇標準曲線的回歸方程:y=0.0093x-0.0116,R2=0.9993。

b.樣品處理:取鮮雞蛋蛋黃加入9倍體積蒸餾水,攪打成乳液。分別取0.500 g樣品于錐形瓶中,加入25 mL稀釋蛋黃液并攪勻,分別調節pH為2.0和7.0,于37 ℃,120 r/min搖床中振蕩4 h,5000 r/min離心30 min。取0.1 mL上清液,采用鄰苯二甲醛法測定樣品膽固醇含量。膽固醇吸附力以公式(6)計算。

膽固醇吸附力(mg/g)=(吸附前蛋黃乳液膽固醇量-吸附后上清液膽固醇量)/干樣品質量

式(6)

1.2.6 紅外光譜測定 采用溴化鉀壓片法處理樣品。稱取適量樣品與KBr粉末混勻并充分研磨。取少量粉末均勻放入壓片機內,壓片5 min后取出放入紅外光譜儀中掃描,掃描范圍為4000～400 cm-1。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,實驗結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 20軟件對數據進行方差分析和顯著性檢驗,并用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對PSDF得率的影響 圖1可見,料液比1∶14～1∶26 g/mL范圍內,PSDF得率隨料液比升高而增大,1∶26 g/mL時得率為11.18%(P<0.05)。這是因料液比過低時,溶液黏度大,不利于PSDF從樣品中溶出;隨料液比升高,增大了樣品中PSDF在溶劑中的溶出機會,得率增大[12]。料液比1∶23～1∶26 g/mL范圍的得率增加幅度明顯低于1∶17～1∶23 g/mL,表明此時得率雖然還處于增加狀態,但增幅已有所下降。料液比過高,提取液體積過大,在后期進行濃縮時所需時間增加,操作中的能耗和工序加大,同時需消耗大量乙醇溶液,生產成本增加[12]。綜合考慮到提取效率減慢和生產成本增加,未選擇繼續擴大料液比。因此,選取1∶20、1∶23、1∶26 g/mL三個水平進行實驗較為適宜。

圖1 料液比對PSDF得率的影響Fig.1 Effects of solid/solvent ratio on PSDF yield注:字母相同表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異顯著(P<0.05)；圖2～圖4同。

2.1.2 酶解溫度對PSDF得率的影響 圖2可見,50～70 ℃時,PSDF得率隨溫度增加而增加,70 ℃時得率最高,為8.62%。可能是因溫度升高加快了水分子運動速率,酶活力增加,促進了蛋白質、淀粉等物質酶解[5],從而增大PSDF得率。溫度高于70 ℃后,PSDF得率顯著下降(P<0.01),80 ℃時降低了14.15%。原因為溫度升高,果膠發生熱降解,果膠鏈降解成小分子寡聚糖和單糖;同時溫度過高會抑制酶活性,降低酶的水解能力,阻礙了PSDF的溶出[5]。因此,酶解溫度選取60、70、80 ℃三個水平較為適宜。

圖2 酶解溫度對PSDF得率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on PSDF yield

2.1.3 超聲功率對PSDF得率的影響 圖3可見,超聲功率200～300 W時,PSDF得率呈上升趨勢,功率300 W時得率最高,為8.58%;當功率大于300 W時,得率降低。與相同條件下未經超聲處理的PSDF得率相比顯著提高了6.41%～19.49%(P<0.05),表明超聲預處理可有效提高PSDF得率。超聲處理可通過分子內加熱和空化效應產生大量空化氣泡,氣泡破裂產生能量促進西番蓮果皮組織細胞壁破裂和細胞物質釋放,幫助溶劑進入組織細胞,增強細胞壁周圍邊界層的傳質[5,13],促進PSDF的溶出。超聲功率300～400 W時得率顯著下降了10.96%(P<0.01)。可能是西番蓮果皮組織細胞在超聲波較強的機械剪切作用下,空化氣泡塌陷產生的熱效應和剪應力導致PSDF降解[5,13],降低了得率。因此,超聲功率選取250、300、350 W三個水平較為適宜。

圖3 超聲功率對PSDF得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on PSDF yield

2.1.4 混合酶量對PSDF得率的影響 圖4可見,PSDF得率隨混合酶量增加呈先增大后減小的趨勢。酶量0.2%～0.5%范圍內,PSDF得率呈增加趨勢;酶量0.5%時,PSDF得率最高,為9.9%。這是因為隨著混合酶量的增加,會有更多的酶活性位點催化原料中淀粉和蛋白質等組分水解,從致密纖維結構中釋放出PSDF[13],增大PSDF得率。混合酶量大于0.5%時,PSDF得率下降了3.43%(P>0.05)。可能是因酶量過高,PSDF質量濃度迅速增大,產物負反饋抑制效應增加,抑制了酶解反應的進行,造成水解度降低[14];同時,酶量過多也可能會破壞部分PSDF,降低PSDF得率。因此,混合酶量選取0.4%、0.5%、0.6%三個水平較為適宜。

圖4 混合酶量對PSDF得率的影響Fig.4 Effects of mixed enzyme content on PSDF yield

2.2 正交實驗

根據單因素實驗結果,以料液比(A)、酶解溫度(B)、超聲功率(C)、混合酶量(D)進行正交實驗。正交試驗試果如表2所示。表2可見,影響PSDF得率由大到小的因素依次是A>D>B>C。PSDF提取最優條件是A3B2C1D3,即料液比1∶26 g/mL、酶解溫度70 ℃、超聲功率250 W、混合酶量0.6%,此時得到PSDF得率為14.82%。由表2可知,正交實驗的PSDF得率整體大于單因素實驗,這是因為試因素實驗和正交實驗分別采用了不同批次的西番蓮,單因素實驗中,西番蓮為成熟后期,膳食纖維含量減少,因為成熟果皮中已有部分果膠水解為果膠酸,不被乙醇沉淀;正交實驗中,西番蓮為成熟初期,其膳食纖維含量較高。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experimental design and result

2.3 PPF與PSDF的理化性質分析

溶脹性和持水力是評價PSDF功能的重要指標,取決于顆粒大小、形狀和疏水-親水相互作用,與其降膽固醇能力密切相關[15]。溶脹性和持水力較高,可促進腸道蠕動、增加糞便體積和水分,使大便松軟,易于有害物質快速排出體外,減輕直腸壓力,預防便秘和結腸癌等[16]。表3可見,PSDF溶脹性與持水力分別為4.98 mL/g和4.93 g/g,與PPF相比差異極顯著(P<0.01),分別增加了52.29%、19.66%。這可能是因為超聲預處理破碎了果皮細胞壁,打開了纖維素分子間的部分氫鍵,親水基團暴露,水結合部位增加[17],提高了PSDF水合性質。

表3 PPF與PSDF理化性質Table 3 Physicochemical properties of PPF and PSDF

堆積密度反映PSDF的疏松程度,堆積密度小的PSDF,其結構疏松,纖維空間和比表面積較大,具良好表面活性[10]。PSDF堆積密度為0.69 g/cm3,與PPF相比顯著下降了24.18%(P<0.05)。因此,提取的PSDF表面活性較好。

PSDF對脂肪和膽固醇的結合能力是評價其對脂溶性組分吸附能力的重要指標[15]。表3可見,PSDF的飽和與不飽和脂肪結合力分別為1.55、1.29 g/g,相較于PPF分別增加了1.97%(P>0.05)、8.4%(P>0.05),表明PSDF脂溶性組分吸附能力有所提高。可能是超聲處理破壞了PSDF原有致密結構,使親水性基團和一些非極性基團更多地暴露出來[17],從而提高了PSDF脂肪結合力。

PPF和PSDF在模擬人體小腸環境(pH=7.0)的膽固醇吸附力均比胃環境(pH=2.0)高。這是因為酸性環境存在較多H+,使PPF、PSDF與膽固醇均帶有部分正電荷,從而產生排斥力,減弱了PPF、PSDF與膽固醇的結合力[11];而PPF和PSDF在中性環境可以更好地吸收多余的脂肪,減少脂肪與膽汁接觸,降低膽固醇含量[11]。表明反應體系酸堿性對膽固醇吸附力有一定影響。PSDF膽固醇吸附力相較于PPF分別顯著增加了16.15%(pH=2.0,P<0.05)、10.47%(pH=7.0,P<0.05)。這是因為PSDF持水力更高(P<0.01),黏度更大,容易被腸道微生物發酵,產生短鏈脂肪酸,發揮生理調節功能,從而吸附膽固醇[2]。同時超聲輔助預處理引起部分不溶性大分子纖維斷裂,轉變為小分子可溶性組分,微晶束減少,空間阻礙降低[18],提高了PSDF膽固醇吸附力。

2.4 PPF與PSDF的紅外光譜分析

圖5為PPF與PSDF中的紅外光譜譜圖。PPF與PSDF分別在3426.01、3435.67 cm-1處表現出較寬的拉伸強烈特征峰,與O-H的拉伸振動有關,表明PPF與PSDF中-OH和結合水分子較多;但PSDF的光譜峰強度有所下降,可能是脫水所致[19-20];PSDF在3435.67 cm-1處的峰形較寬,表明PSDF分子間氫鍵相互作用較強[21]。PPF在2917.72 cm-1處的C-H拉伸振動強度略高于2938.34 cm-1處的PSDF,可能是PPF中木質素、纖維素含量較多[21]。O-H和C-H的存在表明樣品存在典型的多糖結構[20]。在1623.50、1628.01 cm-1處觀察到PPF和PSDF都出現了糖分子中羰基C=O的伸縮振動,說明其存在糖醛酸[20,22];但PSDF中峰的強度明顯小于PPF,表明PPF中醛基或羧基較多[20]。1400 cm-1左右的峰是C-H的振動,為碳水化合物中的-CH引起,是糖類的特征峰[21]。PSDF在1111.37 cm-1處吸收峰較強,可能是吡喃糖環的O-H變角振動吸收峰。此外,PPF和PSDF分別在1052.73、1019.88 cm-1處的強烈吸收帶是碳水化合物的特征,歸因于吡喃葡萄糖結構中C-O-H的O-H的變角振動和C-O-C環內醚中C-O的伸縮振動,也可能是伯醇的混合振動[20-21],是多糖的另一特征吸收峰。PSDF在619.18 cm-1處有一個較強吸收峰,可能存在游離的醇或酚[22]。綜上,PPF和PSDF均可能含有酚類、糖類、胺類、醇類化合物,因含量或結合程度不同,導致其吸收強度有差異。

圖5 PPF與PSDF的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of PPF and PSDF注:a:PPF;b:PSDF。

3 結論

正交試驗結果可知,PSDF最佳提取條件為料液比1∶26 g/mL、酶解溫度70 ℃、超聲功率250 W、混合酶量0.6%,此時PSDF得率為14.82%。最佳工藝條件下提取的PSDF與PPF相比:PSDF溶脹性與持水力極顯著增加了52.29%、19.66%(P<0.01);堆積密度為0.69 g/cm3,下降了24.18%(P<0.05),表明其纖維空間和比表面積增大,表面活性較好;飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸結合力分別增加了1.97%、8.4%(P>0.05),PSDF脂溶性組分吸附能力有所提高;模擬胃環境(pH=2.0)和腸道環境(pH=7.0)下的膽固醇吸附能力分別增加了16.15%、10.47%(P<0.05)。傅立葉紅外光譜分析表明,PPF和PSDF均具有典型的多糖特征吸收峰。