茶籽皂苷調節高脂血癥大鼠血脂的功效研究

林 玲,劉芷君,曾文治,雷鄭延,林全女,程福建,楊江帆,*

(1.福建農林大學園藝學院,福建福州 350002;2.茶學福建省高校重點實驗室,福建福州 350002)

高脂血癥通常指血清中TC和(或)TG水平升高[1],是“三高”之一,時刻威脅著人類的生命和財產安全,我國血脂異常人數高達18.6%[2]。高脂血癥使不利于機體健康的相關物質大量積累,導致肝臟負擔過重、血管血栓沉淀等[3],同時,高脂血癥還會引發動脈粥樣硬化、糖尿病等多種并發癥[2,4-5]。2010～2030年,我國心血管患者人數將因血清膽固醇水平的升高約增加920萬[6]。高膽固醇血癥患者也日趨低齡化[7]。目前市場上治療高脂血癥的藥物繁多,如西藥中的貝特類、煙酸類及他汀類的藥物,但長期使用將產生副作用、耐藥性及依賴性等反應[1]。因此研究與開發副作用低的保健產品勢在必行。

20世紀60年代,茶葉的保健功效逐漸引起人們的關注,人們對茶葉中的生物活性成分進行了深入研究,主要包括茶多酚、黃酮類及茶氨酸等物質,但茶皂苷仍未引起關注。直到2005年,Yoshikawa等[8]發現茶花皂苷Floratheasaponin A-C有較好的抑制TG的作用。隨后幾年,國內外學者陸續開展對茶皂苷降血脂功效的研究。Ye等[9]用油茶皂苷及其水解產物喂食高脂血癥小鼠,發現可降低TC、TG和低密度脂蛋白(low density lipoproteins,LDL),并增加高密度脂蛋白(high density lipoproteins,HDL)的含量。王延芳[10]的研究也驗證了這一結論。吳文鶴等[11]發現茶樹根皂苷可調控血脂水平。Afrose等[12]發現茶樹根皂苷能顯著降低血清中LDL、TG和TC的含量。目前,針對茶皂苷調節血脂的研究多選用油茶籽、茶樹花、茶樹根等部位的皂苷,尚未發現以茶籽皂苷為對象的研究,同時對肝脂肪變性、肝功能、抗氧化水平影響以及調節血脂機制的研究匱乏。

茶皂苷是一類齊墩果烷型五環三萜類皂苷的混合物,由皂苷元、糖體、有機酸三部分組成。科研工作者從同一物種中分離出不同的皂苷,到目前已從山茶屬植物的根、莖、葉、花和種子中分離和鑒定了188種皂苷單體,其中,87種來自茶(CamelliasinensisL.),33種來自日本山茶(CamelliajaponicaL.),24種來自阿薩姆茶(CamelliasinensisL. var.assamicaPierre),37種來自油茶(CamelliaoleiferAbel.),7種來自茶梅(CamelliasasanquaThunb.);大部分皂苷(72種)分離于山茶屬植物的種子,其中在茶籽中發現39種;在茶樹花中發現16種、根莖中10種、茶葉中9種,其他13種。它們結構相似又有所不同,比如茶籽皂苷和茶葉皂苷:皂苷元結構眾多,其中R1-黃槿精醇和A1-黃槿精醇是茶葉皂苷具備而茶籽皂苷不具備的;關于有機酸,茶葉皂苷為當歸酸、惕各酸和肉桂酸,而茶籽皂苷中不具有肉桂酸;二者糖體相同[13-14]。對茶樹的利用多集中在其葉片上,除了一小部分茶籽用于育種外,其余多被廢棄。據農業部種植業管理司統計,2016年全國茶園面積2902100 hm2,按每畝茶園產茶籽50 kg,我國每年潛在茶籽資源約217. 7萬t,茶皂苷作為茶籽主要有效成分,具有重大開發潛力。

因此本文選用茶籽皂苷進行動物實驗,通過病理切片以及對大鼠血脂和抗氧化指標的檢測研究其調節血脂的功效,為茶皂苷降血脂產品的開發提供理論支持,以期為茶深加工產業的發展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶籽皂苷 湖南漢清生物技術有限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC) 上海源葉生物科技有限公司;辛伐他汀片 湖北廣濟藥業股份有限公司;SPF級雄性Wistar大鼠60只,體重(200±20) g 上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK(滬)2012-0002;對硝基苯酚、水合氯醛(分析純) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;SOD、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所;高脂飼料(輻照) 北京博愛科貿有限公司(配方:蛋黃粉10%、豬油5%、膽固醇5%、膽鹽0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、基礎飼料79.3%);普通飼料 福建中醫藥大學實驗動物中心。

KDC-2046低速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;日立7180全自動生化分析儀 株式會社日立制作所;TE601-L電子天平 德國賽多利斯公司;UV-2700紫外可見分光光度計 SHIMADZU Corporation。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立與分組 本實驗在福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級屏障動物實驗室進行。大鼠飼養環境:室溫22～26 ℃,相對濕度40%～70%,明暗交替條件為12 h/12 h。大鼠均在同一環境下隨機分籠飼養,每籠5只,自由飲水攝食。

60只雄性Wistar 大鼠適應性喂養1周后隨機分為10只正常組和50只造模組。正常組飼喂基礎飼料,造模組飼喂高脂飼料。4周后禁食12 h斷尾取血,檢測TC 與正常組有顯著差異(P<0.05),則造模成功,將造模組按體重隨機分為模型對照組、陽性對照組和茶籽皂苷低、中、高劑量組。各組按照表1給藥方式每日上午定時連續給藥四周,末次給藥后24 h(禁食不禁水12 h),10%水合氯醛麻醉(2 mL/kg,腹腔注射)大鼠取樣保存待測。所用灌胃藥物均使用0.5%羧甲基纖維素鈉作為溶劑進行配制。

表1 動物分組與給藥方法Table 1 Animal grouping and administration method

1.2.2 大鼠基礎指標測定 實驗開始的第一天、最后一天所有大鼠稱重,期間每周定時稱量大鼠體重,每日記錄和觀察大鼠精神狀態、飲水、飲食量等情況。大鼠取樣后計算大鼠肝臟指數,肝臟指數(%)=肝臟濕重(g)/體重(g)×100。

1.2.3 大鼠血清生化指標檢測

1.2.3.1 常規生化指標測定 自大鼠腹主動脈取血,于3 000 r/min離心10 min后取血清,采用全自動生化分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT含量,計算AI指數:AI=([TC]-[HDC-C])/[HDL-C]。

1.2.3.2 MDA、SOD含量測定 分別采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法和羥胺法,按各試劑盒說明測定MDA和SOD含量。

1.2.4 組織形態學觀察 取各組大鼠部分肝臟用0. 9%氯化鈉溶液沖洗,浸泡于通用型組織固定液過夜,經石蠟包埋及切片后得到約4 μm 的切片,用HE染色后至光鏡觀察細胞形態[15]。

1.3 數據處理

數據以均數±標準差(x±s)的形式表示。使用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析,差異顯著性用P<0.05(顯著)或P<0.01(極顯著)表示。

2 結果與分析

2.1 模型建立

造模4周后,造模組血清TC(2.10±0.09 mmol/L)明顯高于正常組(1.36±0.03 mmol/L),有統計學意義(P<0.01),說明高脂血癥模型已成功建立[1,16-18]。

2.2 大鼠狀態行為分析

藥物干預過程中,C組大鼠精神狀態好,活潑好動且反應敏捷,H組大鼠體態變大,精神相對萎靡,活動量少。而攝入茶皂苷和辛伐他汀的TSL組、TSM 組、TSH組以及P組大鼠體態較H組小,精神狀態較好,活動有所增多。如表2所示,各組大鼠每周平均每天飲水量和飲食量不存在顯著差異(P>0.05),說明茶籽皂苷抑制大鼠體重增長并非通過減少其食物攝入實現的。

表2 各組大鼠飲水量和飲食量Table 2 Water consumption and diet of rats in each group

2.3 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠體重、肝臟指數的影響

肥胖與高脂血癥及動脈粥樣硬化關系密切,而體重是大鼠肥胖程度最直觀的顯示指標之一[19-20]。如圖1所示,干預前,造模組各組大鼠的體重并無顯著差異(P>0.05)。干預4周后,H組大鼠體重相比C組極顯著提升(P<0.01);而P組、TSL組、TSM組、TSH組大鼠體重雖高于C組,但較H組都有所下降,其中P組、TSH組極顯著降低(P<0.01),TSM組顯著降低(P<0.05),TSL組也有所降低,但無統計學意義,說明茶籽皂苷能控制高脂血癥大鼠的體重,與P組相一致,且呈量效關系。

圖1 大鼠體重變化趨勢Fig.1 Variation of body weight of rats注:與C組比較,##表示極顯著(P<0.01),#表示顯著(P<0.05);與H組比較,**表示極顯著(P<0.01),*表示極顯著(P<0.05),圖2、圖4、表3、表4同。

肝臟指數變化可以較好地判斷肝臟的損傷情況,增加表示肝臟有充血、水腫、增生及肥大等變化,下降則表示臟器萎縮、生長受阻或退行性變[21]。如圖2所示,H組大鼠的肝臟指數比C組極顯著提高(P<0.01),與H 組相比,P組、TSM 組、TSH組的肝臟指數極顯著下降(P<0.01),TSL組沒有顯著性差異。H 組大鼠肝臟指數極顯著地升高可能與一系列的病理變化有關,經過茶籽皂苷和辛伐他汀的干預可能對肝臟的病理性變化有所改善。

圖2 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠肝臟指數的影響Fig.2 Effect of tea seed saponin on liver index in rats with hyperlipemia

2.4 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠血脂水平的影響

臨床上血脂檢測的基本項目為TC、TG、LDL-C和HDL-C。AI為醫學中用以觀察動脈硬化程度的指標,AI值的升高,能促進HDL-C將血液中的膽固醇運到肝臟進行轉化和排泄,以降低血液中膽固醇濃度,促進大鼠外周組織細胞中的膽固醇向肝臟轉運,從而減少其在外周組織中的聚集和對血管內皮細胞的廣泛性損害[1,22]。由表3可知,給藥4周后,與C組相比,H組大鼠血清中TC含量和AI指數極顯著升高(P<0.01),HDL-C 含量極顯著降低(P<0.01),TG、LDL-C含量顯著升高(P<0.05);與H 組相比,TC含量P組、TSL組、TSM組、TSH 組均極顯著降低(P<0.01);TG含量P組、TSH組極顯著降低(P<0.01),TSL組、TSM組顯著降低(P<0.05),以TSH 組效果最佳,甚至優于P組;HDL-C 含量P組、TSH組極顯著升高(P<0.01),TSL組、TSM組顯著升高(P<0.05);LDL-C含量P組極顯著降低(P<0.01),茶籽皂苷各組有所降低,但無顯著性差異;AI指數P組、TSM組、TSH 組極顯著降低(P<0.01),TSL組顯著降低(P<0.05)。研究結果表明,茶籽皂苷對由高脂飼料誘發的高脂血癥大鼠的血脂水平具有較好的調節作用,對動脈硬化也有一定的改善作用,且呈量效關系,茶籽茶皂苷高劑量組對大鼠血脂的調節效果最佳。

表3 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠血脂含量的影響Table 3 Effect of tea seed saponin on blood lipids in rats with hyperlipemia

2.5 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠肝功能的影響

肝為脂類、糖類以及蛋白質代謝的主要器官。ALT和AST是肝功能的代表性指標,其數值的高低直接地體現肝細胞的損傷程度,越高表明肝臟受損程度越大[23]。如表4所示,H組的ALT與AST含量比C組極顯著提高(P<0.01);與H 組相比,P組、TSH組的ALT與AST含量顯著下降(P<0.05),TSL組、TSM組無顯著性差異,說明高脂血癥會使大鼠肝功受損,而茶籽皂苷和辛伐他汀擁有一定的保肝功效,且茶籽皂苷以高劑量的效果最佳。

表4 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠ALT、AST含量的影響Table 4 Effect of tea seed saponin on ALT and AST content in rats with hyperlipemia

2.6 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響

不同處理大鼠的肝組織HE染色切片如圖3所示。C組大鼠肝臟細胞結構規則整齊,肝竇清晰可見,未出現肝細胞脂肪變性。H組大鼠肝臟細胞腫脹、體積增大,眾多大小不一的脂滴出現在胞漿內,細胞間隙增大,完整性較差,結構輪廓模糊,部分細胞甚至解體,說明高脂血癥可引起肝臟的病理性變化。與H組比,P組、TSL組、TSM組、TSH 組均可不同程度改善大鼠肝臟細胞脂肪變性,縮小胞漿內脂滴體積,減少其數量,肝竇更為清晰,且呈量效關系,以TSH組效果最佳,甚至優于P組。脂肪肝發生率隨著TG濃度的增高而升高[24],肝臟切片的結果正好與血清TG的結果相呼應,因此推測是因茶籽皂苷能有效降低血清TG含量,致使其改善肝臟脂肪變性效果佳。

圖3 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響(200×)Fig.3 Effect of tea seed saponin on fatty degeneration of liver in rats with hyperlipemia(200×)

2.7 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠抗氧化水平的影響

MDA是脂質過氧化終產物之一,可間接反映過氧化損傷程度。SOD可清除超氧陰離子自由基,反映機體的抗氧化能力[25-26]。如圖4所示,相比C 組,H組大鼠血清中SOD含量極顯著降低(P<0.01)、MDA含量極顯著升高(P<0.01);與H 組相比,P組血清SOD含量極顯著升高(P<0.01),TSL組、TSM組、TSH組顯著提高(P<0.05);P組、TSM 組、TSH 組的血清MDA含量極顯著下降(P<0.01),TSL組無顯著性差異。結果表明茶籽皂苷和辛伐他汀能提高高脂血癥大鼠血清SOD活性,降低MDA活性,能提高抗氧化水平,改善高脂血癥帶來的氧化損傷,從而改善大鼠血脂水平。

圖4 茶籽皂苷對高血脂癥大鼠抗氧化水平的影響Fig.4 Effect of tea seed saponins on antioxidant level in rats with hyperlipidemia

3 結論

本研究結果表明,適當劑量的茶籽皂苷(50～150 mg/kg)能有效調節高脂飼料誘導的高脂血癥大鼠的血脂水平,且其效果與劑量濃度成正比。TSH組的體重、肝臟指數、血清TC、TG、AI指數極顯著降低(P<0.01),HDL-C極顯著升高(P<0.01),ALT與AST顯著下降(P<0.05),肝臟脂肪變性的程度明顯改善,SOD顯著提高(P<0.05),MDA極顯著下降(P<0.01);TSM組的體重、血清TG顯著降低(P<0.05),肝臟指數、血清TC、AI指數、MDA極顯著下降(P<0.01),HDL-C、SOD顯著升高(P<0.05),肝臟脂肪變性的程度改善;TSL組的體重、肝臟指數、MDA沒有顯著性差異,血清TC極顯著降低(P<0.01),TG、AI指數顯著降低(P<0.05),HDL-C、SOD顯著升高(P<0.05),肝臟脂肪變性的程度改善。綜上所述,茶籽皂苷能調節喂食高脂飼料致大鼠高脂血癥模型的血脂水平,減輕肝臟脂肪變性程度,同時還能改善高脂血癥帶來的氧化損傷和肝臟損傷,提高機體的抗氧化能力,有望成為安全有效的抗高脂血癥候選藥,但其機制有待進一步完善檢驗。