芹菜不同部位提取物對調節大鼠高血壓與血脂代謝紊亂作用機制研究

孫華林,田奎蓉,洪 業,吳夢丹,陳軼霞,劉俊林

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030)

高血壓是以動脈血壓超過臨界血壓值并持續升高為主要特征的綜合病癥,同時伴有肝、心、腎等多個組織器官結構、功能改變,影響局部微循環,導致代謝失衡的慢性疾病[1]。經大量臨床病征和生理學研究,高血壓發病機制受復雜的通路調節,并且受一系列外環境影響[2-4],尤以自由基代謝失衡、血液脂質代謝紊亂和水鹽調節異常等因素為主要表現[5-8]。同時長期高血壓會過度激活“腎素-血管緊張素-醛固酮系統”(RAAS)而引起心臟組織肥大導致心臟衰竭,因此,調整機體的RAAS水平、改善機體血脂代謝紊亂與調節水鹽代謝異常是治療高血壓的關鍵[9]。

芹菜(ApiumgraveolensL.)屬傘形花科蔬菜,植株中含有豐富的黃酮類化合物,以芹菜素含量最高,芹菜素(apigenin)又稱芹黃素,是天然存在的一種黃酮類化合物,其獨特的生理學效應和生物學特性來源于黃酮結構所含的三個-OH與C2=C2基團[10]。其具有降壓安神、降血脂、保護心血管和增強免疫力等功效[11-12],何芳等[13]研究發現芹菜素能降低高脂高鹽所致高血壓大鼠血壓并有保護心臟的作用,可能與芹菜素能夠有效降低高脂高鹽所致高血壓大鼠AngII水平、降低血脂、改善抗氧化酶活性、抑制氧化應激損傷有關。

本研究主要探討芹菜不同部位提取物與芹菜素作用于高鹽高血壓大鼠模型,分析比較芹菜各部位提取物與芹菜素對改善高鹽所致大鼠高血壓與血脂代謝紊亂的效果與其機制進行探究,并分析二者對高血壓的作用關系,以期為篩選芹菜藥食同源食用最佳部位及其作為天然產物作用于臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物:200～250 g Wister大鼠90只雌雄各半 購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所(實驗動物許可證號:SYXK(甘)2015-0001)實驗大鼠飼養、實驗和處死均遵照實驗動物管理條例和福利倫理指南執行;蘭州本地毛芹(Apiumgraveolens) 全株經西北民族大學劉俊林副教授鑒定為毛芹;TG試劑盒、HDL-C試劑盒、LDL-C試劑盒、CHOL試劑盒 均購自南京建成生物有限公司;碘[125Ⅰ]血管緊張素Ⅰ放射免疫分析藥盒、碘[125Ⅰ]血管緊張素Ⅱ放射免疫分析藥盒碘[125Ⅰ]、醛固酮放射免疫分析藥盒、碘[125Ⅰ]腎素活性放射免疫分析藥盒 均購自北京北方生物技術研究有限公司;芹菜素(95%) 購自上海純優生物科技有限公司;給藥對照藥物“卡托普利” 常州制藥廠有限公司;乙腈(色譜級) 南京化學試劑股份有限公司;其余藥品均為國產分析純。

Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀、Beckmanγ計數器 美國Beckman公司;XH6020全自動放射免疫計數儀 中國同輻股份有限公司;N-1100D旋轉蒸發器 上海安亭科學儀器廠;UV-1800紫外分光光度計、HPLC-SPD 15C高效液相色譜儀、UV CBM-20A數據處理系統 日本島津公司;Biotek多功能酶標儀 北京諾亞威儀器儀表有限公司;FD-1C-50真空冷凍干燥儀 北京博醫康實驗儀器有限公司;3K30超速低溫離心機 Sigma公司;SL-N精密電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;KW-I恒溫干燥箱 上海躍進醫療器械廠;Nikoncoolpix 4500數碼照相機 日本尼康公司;ML-1.8-4可調式電熱板 北京科偉永興儀器有限公司;LEICA-DM500光學顯微鏡 德國萊卡公司;MICROM HMS70自動染色儀 德國MICROM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芹菜各部位提取物的制備 將毛芹洗凈后分離根、莖、葉切碎置于80 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重,充分研磨粉碎,70 ℃、70%乙醇浸提2 h,60目篩過濾后收集濾液,重復三次,合并樣液[10],轉入真空冷凍干燥器(-60 ℃),干燥至恒重,分別得到芹菜根提取物、芹菜莖提取物與芹菜葉提取物。

1.2.2 芹菜素含量的測定 采用HPLC法進行測定:色譜柱:WondaSilC18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(35∶65,V/V);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;UV檢測,檢測波長:270 nm[14]。以縱坐標y為吸收峰,橫坐標x為濃度建立回歸方程:y=539223x-356988;R2=0.996。

1.2.3 大鼠高血壓模型的建立及治療過程 對實驗組和模型組飼喂高鹽大鼠飼料和飲用0.6%氯化鈉液,持續6周[15],待其動脈血壓超過150 mmHg并保持穩定時確立模型建立。模型建立后取72只建模成功大鼠均分為6組,每組12只。取1.2.1中提取所得芹菜葉、莖、根物質按3.0 g/kg·BW(芹菜素含量分別為27.34、21.77、17.67 mg/g)對芹菜根組、芹菜葉組、芹菜莖組進行給藥。芹菜素組給予0.11 g/kg·BW芹菜素,給藥對照組給予卡托普利(0.042 mg/kg·BW),以健康大鼠作為正常組,模型組與空白組給予等量正常飲用水,持續治療4周。

1.2.4 大鼠體重變化 治療期間每周對各組大鼠進行稱重,觀察大鼠體質量改變情況。

1.2.5 大鼠“RAAS系統”含量變化測定 治療結束后,皮下注射戊巴比妥麻醉固定,頸側動脈采血,2500 r/min,4 ℃離心10 min后吸取血清,按照各試劑盒要求添加抗凝劑與碘標記物測定血清中血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)的含量以及腎素活性(PRA)。

1.2.6 大鼠血漿中TG、HDL-C、LDL-C、CHOL的含量測定 采用頸側動脈采血方法分別取各組大鼠靜脈血,按照TG、HDL-C、LDL-C、CHOL試劑盒流程,進行含量測定,各試劑盒測定標準方程相關系數r均≥0.995。

1.2.7 大鼠心臟系數(CWI)和心肌增值系數(MPI)的測定 給藥治療4周后,稱量各組大鼠體質量,頸椎脫臼處死后快速摘除心臟并稱重,沿二尖瓣剝離左心室稱重,計算CWI和MPI[16]。

1.2.8 大鼠心臟組織切片觀察 取各組大鼠左心室組織4%甲醛浸泡完全,進行石蠟組織切片及HE染色等操作[17],觀察各組大鼠心臟病變情況。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 芹菜素標準品及芹菜各部位提取物HPLC圖譜

根據GB/T 19427-2003[14]方法測定所得:芹菜各部位提取物中存在多個吸收峰,如圖1所示,除了在3.425 min處有芹菜素明顯特征吸收峰以外,4.207、6.0142、6.554 min處還存在三個較高吸收峰,考慮是芹菜(葉、莖、根)各部位提取物存在多種黃酮類物質,三個峰總面積分別占芹菜各部位總提取物的26.420%、76.799%、21.694%,可見蘭州毛芹中非芹菜素特征黃酮物質含量非常豐富,其潛在研究價值較高。

圖1 95%芹菜素及芹菜各部位提取物HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of 95% apigenin and extracts from different parts of celery注:A:芹菜素標準品 B:芹菜各部位提取物(a:芹菜葉提取物;b:芹菜莖提取物;c:芹菜根提取物)。

2.2 芹菜不同部位提取物對大鼠動脈血壓變化的影響

如表1所示,第0周時模型組、實驗組(芹菜根組、芹菜莖組、芹菜葉組)與給藥對照組大鼠動脈血壓均高于正常組大鼠血壓,且均超過150 mmHg,即說明模型建立成功。經治療后第4周時,芹菜葉組、芹菜素組與給藥對照組大鼠動脈血壓與模型組相比有極顯著降低(P<0.01);芹菜莖組大鼠動脈血壓與模型組相比顯著降低(P<0.05);芹菜根組大鼠血壓治療前后改變并不顯著(P>0.05);模型組大鼠動脈血壓隨時間延長呈增加趨勢,正常組大鼠動脈血壓并未增高。芹菜各部位提取物對高鹽所致大鼠高血壓均有一定的降壓作用,以芹菜葉組提取物與芹菜素降壓作用效果最為明顯;芹菜葉提取物組與芹菜素組兩組降壓效果相近,可能與芹菜葉中含有大量芹菜素有關。

表1 大鼠動脈血壓變化Table 1 Changes in arterial blood pressure in rats

2.3 大鼠體質量變化

如圖2所示,模型組大鼠體質量隨治療時間增加而呈現降低趨勢,實驗組大鼠體重有小幅波動,但隨治療時間延長均呈現增長的趨勢。

圖2 大鼠體質量變化Fig.2 Changes in rat body mass

2.4 芹菜不同部位提取物對大鼠“RAAS系統”含量變化影響

如表2所示,模型組血漿中AngⅠ含量與正常組相比有極顯著降低(P<0.01),AngⅡ含量與正常組相比有極顯著性增高(P<0.01);芹菜根組血清中AngⅠ含量與正常組相比具有顯著性降低(P<0.05);芹菜根組、芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組大鼠血漿中AngⅠ含量與模型組相比有極顯著增高(P<0.01),芹菜根組與芹菜莖組血漿中AngⅡ含量與正常組相比具有極顯著性增高(P<0.01);芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組大鼠血漿中AngⅡ含量與模型組相比有極顯著降低(P<0.01),芹菜根組大鼠血漿中AngⅡ含量與模型組相比有顯著降低(P<0.05),并且芹菜葉組與芹菜素組降低最為明顯。AngⅡ能使全身小動脈收縮而升高血壓,具有很強收縮血管的能力[18]。可見,芹菜各部位提取物能有效降低血液中AngⅡ的含量,從而達到減弱血管收縮,降低血壓。

表2 大鼠血漿中AngⅠ、AngⅡ含量Table 2 Contents of AngI and AngII in rat plasma

如表3所示,模型組血漿中PRA與正常組相比具有極顯著性增高(P<0.01);芹菜根組和芹菜莖組血漿中PRA與正常組相比具有顯著性增高(P<0.05);各組ALD與模型組相比均無較大改變,不具備統計學意義,芹菜葉組、芹菜素組、給藥對照組與正常組大鼠血漿中PRA與模型組相比有顯著降低(P<0.01),芹菜根組與芹菜莖組大鼠血漿PRA與模型組相比有顯著降低(P<0.05)。隋海霞等[19]研究發現芹菜素作用下能降低大鼠血漿中ALD,本實驗中芹菜各部位提取物作用下能降低大鼠血漿中ALD的含量與PAR活性,從而減弱血管收縮,降低血壓,而芹菜各部位提取物作用效果有所差異,可能與各部位提取物中所含芹菜素含量不同有關。

表3 大鼠血漿中ALD含量與 PRA Table 3 ALD content and PRA activity in rat plasma

2.5 芹菜不同部位提取物對大鼠血漿中TG、HDL-C、LDL-C、CHOL的含量變化影響

如表4所示,模型組大鼠血漿中HDL-C、LDL-C 與TG含量與正常組相比具有極顯著性差異(P<0.01);芹菜素組大鼠血漿中HDL-C含量與模型組相比有極顯著增高(P<0.01),芹菜葉組與給藥對照組大鼠血漿中HDL-C含量與模型組相比顯著增高(P<0.05);芹菜莖組、芹菜素組、給藥對照組與正常組大鼠血漿中LDL-C含量與模型組相比有極顯著降低(P<0.01),芹菜根組、芹菜葉組大鼠血漿中LDL-C含量與模型組相比顯著降低(P<0.05);芹菜根組和芹菜莖組大鼠血漿中TG含量與正常組相比有極顯著性增高(P<0.01);芹菜素組、給藥對照組大鼠血漿中TG含量與模型組有顯著性降低(P<0.01),芹菜葉組大鼠血漿中TG含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)。芹菜各部位提取物作用下,能升高大鼠血漿中HDL-C含量,降低血清中LDL-C與TG含量,有效改善高鹽大鼠高血壓脂代謝紊亂情況[20]。

表4 大鼠血漿中TG、HDL-C、LDL-C的含量Table 4 Contents of HDL-C,LDL-C,and TG in rat plasma

如圖3所示,模型組與芹菜根組血漿中CHOL含量與正常組相比有極顯著性降低(P<0.01);芹菜莖組與芹菜葉組血清中CHOL含量與正常組相比有顯著性降低(P<0.05);芹菜素組、給藥對照組血清中CHOL含量與模型組相比有極顯著性增高(P<0.01);芹菜根組、芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組大鼠血漿中CHOL較模型組均有增高但與模型組相比并無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 血漿中CHOL含量Fig.3 CHOL content in plasma

2.6 芹菜不同部位提取物對大鼠心臟系數(CWI)和心肌增值系數(MPI)的影響

如表5所示,與正常組相比,模型組CWI與MPI均有所升高,但無顯著性差異。與模型組相比,各組CWI與MPI均無顯著性差異,其中,芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組CWI與模型組相比均有所降低,并且芹菜莖組、芹菜葉組、芹菜素組CWI降低程度基本一致,芹菜根組、芹菜葉組、芹菜素組MPI與模型組相比較低,芹菜素組降低最為明顯。芹菜素作用下能有效降低大鼠CWI與 MPI[21],在芹菜各部位提取物作用下,表現出能降低大鼠CWI與MPI,減弱因血壓升高而導致的心臟肥大和心肌增生,具有保護心臟的作用。各提取物作用能力各異可能與芹菜各部位所含芹菜素含量與黃酮類物質種類有所相關。

表5 大鼠心臟系數(CWI)和心肌增值系數(MPI)Table 5 Rat heart coefficient(CWI)and myocardial value-added coefficient(MPI)

2.7 大鼠心臟切片觀察

圖4a與圖4g相比:心肌細胞水腫心肌纖維間隙增寬,部分心肌纖維斷裂并伴有紅細胞浸潤,心肌細胞核有發生核溶解、核碎裂情況,心肌周圍有炎性細胞浸潤。芹菜根提取物作用下對高鹽高血壓大鼠心臟病變情況改善效果并不顯著,但能減少心肌纖維內出血與心肌纖維斷裂情況;圖4b與圖4g相比:心肌細胞水腫,心肌纖維間隙有所增寬,心肌纖維斷裂情況不明顯,仍有部分紅細胞充斥于心肌纖維內部,心肌細胞核有部分溶解、碎裂。芹菜莖提取物作用下能有效減少高鹽高血壓大鼠心肌纖維斷裂和心肌纖維內出血情況,同時減少心肌細胞壞死情況;圖4c與圖4e相比:心肌細胞水腫消退,心肌纖維無斷裂情況,纖維內部無紅細胞浸潤現象,細胞核完整,有輕微炎性細胞浸潤。芹菜葉提取物作用下能有效改善高鹽高血壓大鼠心肌病變情況,除心肌纖維間有輕微炎性細胞浸潤外,病變情況基本消失;圖4d與圖4e相比:心肌細胞水腫消退,心肌纖維完整,心肌細胞無變性壞死現象,纖維內部無紅細胞浸潤現象,細胞核完整;芹菜素作用下,高鹽高血壓大鼠心肌基本無病變情況出現;圖4e與圖4g相比:心肌細胞水腫,心肌纖維致密,心肌纖維內有大量出血形成血腫,心肌纖維斷裂嚴重,心肌中充滿炎性細胞,心肌細胞變性壞死嚴重。高鹽高血壓大鼠心肌病變嚴重,同時有大量心肌增生與大量出血,與血壓不斷升高和血脂代謝紊亂有關;圖4f與圖4e相比:心肌細胞水腫消退,心肌纖維有輕微斷裂情況,伴隨輕微炎性細胞浸潤,無出血現象;圖4g心肌細胞正常,心肌纖維完整,無出血現象和炎性細胞浸潤情況。

圖4 大鼠心臟切片結果Fig.4 Rat heart section results注:a～g圖分別為芹菜根治療組、芹菜莖治療組、芹菜葉組大鼠、芹菜素組、模型組、給藥對照組、正常組大鼠心臟左心室切片(200×)。

3 討論與結論

高鹽性高血壓是指在長期攝入高鹽高脂類物質后引發機體脂質和水鹽代謝紊亂,引起“腎素-血管緊張素-醛固酮系統”(RAAS)過度激活,AngⅠ向AngⅡ快速轉化,導致血漿AngII水平顯著升高[22-23],引起血管持續收縮造成血壓升高;同時引起血漿中HDL-C降低,TG、LDL-C、CHOL水平升高,血壓持續上升造成心肌過度拉伸、心臟負荷過重引起導致心肌肥大,并可導致心衰,心肌纖維過度拉伸甚至斷裂,心肌內伴隨持續出血和炎性細胞浸潤的情況[22-25],最終高血壓合并高血脂,造成機體器官負擔過重引發諸多并發癥如糖尿病、腎病等的一種疾病[26]。因此抑制“RAAS系統”過度激活,降低血漿AngⅡ水平,改善因血脂代謝紊亂所致心臟組織器官病變、壞死是治療高血壓的關鍵因素。

本研究采用高鹽飼料飲水飼喂大鼠進行高鹽性高血壓大鼠造模,考察了芹菜不同部位提取物對高鹽高血壓大鼠降壓效果并對其機制進行探究,實驗結果顯示:芹菜不同部位提取物與芹菜素能有效降低腎素活性(PRA),降低血漿中AngⅡ含量,對“RAAS系統”過度激活具有明顯的抑制作用,能夠達到降低動脈血壓的效果;芹菜不同提取物作用下與模型組相比能夠改善大鼠血脂代謝異常的情況,有效升高血漿HDL-C水平,降低LDL-C、TG與CHOL,表現出能降低CWI與MPI減輕大鼠因心臟腫脹而造成的大鼠心負擔過重,減輕心肌細胞水腫,減少心肌纖維斷裂,維持心肌細胞細胞核完整的能力。結合檢測結果與組織切片觀察綜合分析可見芹菜葉、莖提取物對大鼠高血壓具有良好的治療作用。同時,改善血脂異常情況有助于降低高血壓,能緩解由于高血壓引起的心臟等組織器官過負情況,對局部循環具有調節作用。芹菜食療藥用價值顯著,蘭州毛芹各部位提取物種中非芹菜素特征圖譜黃酮物質含量頗豐,相關生物活性機制具有較高潛在研究價值,其特征類物質對降脂降壓通路機制有待進一步研究。