沙棘蛋白的特性及其對db/db糖尿病小鼠的降血糖作用

劉洪霞,舒丹陽,劉鵬展,崔 春,*

(1.完美(廣東)日用品有限公司,廣東中山 528400;2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

沙棘(HippohaerhamnoidesL.)是一種天然的藥食同源性植物,我國是沙棘資源最豐富的國家,沙棘屬種植總面積達到92萬hm2。沙棘的根、莖、葉、花、果實中均含有豐富的營養和生物活性物質。根據《中華人名共和國藥典》記載,沙棘“具有止咳祛痰、消食化滯、活血散瘀功能”,充分肯定了它的藥用價值。沙棘在民間還有“長壽果”的美譽,特別是藏醫和蒙醫使用較多[1]。沙棘具有抗腫瘤[2]、抗光老化[3]、抗氧化[4]、排鉛[5]等多種活性。沙棘籽是沙棘果汁生產的副產物。沙棘籽經過超臨界提取油脂后得到的沙棘籽粕中蛋白質含量豐富,約為20%～25%,富含多種人體所需氨基酸,是一種優質的功能性蛋白資源[6]。研究表明,沙棘蛋白能夠改善血脂水平,調節腸道菌群[7];還能改善高血糖引起的細胞炎癥[8]。

糖尿病是全球性的公共健康問題,是一種常見的慢性代謝疾病,主要表現為糖代謝紊亂,其病因諸多,機制復雜,已經成為繼心血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大疾病[9]。近10年來糖尿病流行情況日益普遍,預計至2030年全球糖尿病患者將達到4.39億,其中2型糖尿病約占患病總人數的90%[10]。藥物降血糖會產生多種副作用,降低骨密度增加骨折的風險[11],產生肝毒性[12],還可造成腸道功能紊亂[13]。所以研究人員更傾向于利用草本植物和通過功能性食品調節膳食結構從而控制血糖。

沙棘多糖,沙棘果,沙棘葉提取物均有降血糖的功效[14-16],但對沙棘蛋白降血糖方面的相關研究較少。長期以來,飲食干預一直被認為是控制血糖的有效措施[17],一些研究表明,用大豆蛋白等植物蛋白替代動物蛋白來改善糖尿病患者的血脂異常,對脂質分布有有益的影響,并可減少糖尿病腎病的損傷[18]。本文通過動物實驗進一步研究沙棘蛋白對2型糖尿病小鼠的降血糖作用及其機制,以期為利用沙棘蛋白開發保健品、藥品的研發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

60只雄性SPF級db/db糖尿病模型小鼠(47±2) g,12只雄性SPF級m/m正常小鼠(24±2) g 購于常州卡文斯實驗動物有限公司;沙棘籽粕(蛋白含量20%～23%) 由完美康普高原特色植物研究中心提供;沙棘蛋白 由實驗室制備(其蛋白含量為80%);二甲雙胍 廣州白云上天心制藥股份有限公司;其他試劑 均為分析純。

血糖儀及試紙條、德國羅氏活力血糖儀 羅氏診斷產品(上海)有限公司;電子天平 莆田市衡科儀器有限公司;中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;恒溫振蕩器 江蘇金怡儀器科技有限公司;雷磁PHS-3EpH計 上海儀電科學儀器有限公司;自動定氮儀、HYP-308消化爐 上海纖檢儀器有限公司;L-8900日立全自動氨基酸分析儀 天美(中國)科學儀器有限公司;Waters高效液相色譜儀 美國Waters公司;冷凍干燥機 東莞布魯斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘蛋白制備工藝 經超臨界提取油脂后的沙棘籽粕超微粉碎80目過篩,料液比1∶5,75%乙醇浸洗2次,去掉醇溶性雜質。1∶9料水比,6 mol/L氫氧化鈉調pH11.0堿提取3 h,2 mol/L鹽酸調pH5.0酸沉0.5 h,去離子水水洗兩次酸沉蛋白,除去鹽分,冷凍干燥(-45 ℃、9 Pa、24 h)得沙棘蛋白,4 ℃保存備用[6]。

1.2.2 沙棘蛋白含量的測定 總蛋白含量測定:采用凱氏定氮法[19],參照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》。

稱取0.25 g左右的凍干沙棘蛋白于消化管中,加入10 mL濃硫酸和10 g催化劑,高溫自動消化爐上450 ℃消化2 h至澄清透明,冷卻后用自動定氮儀測定蛋白含量。

1.2.3 沙棘蛋白分子量的測定方法 采用凝膠色譜法測定肽分子量分布。檢測條件:高效液相色譜(Waters 600),TSK gel G2000SWXL 凝膠色譜分析柱;檢測波長為 220 nm;檢測時間30 min;有機流動相(乙腈∶水=20∶80,加入0.1%的三氟乙酸),流速0.5 mL/min。將樣品用上述流動相稀釋,過0.22 μm濾膜,進樣體積為20 μL,進行分析。

標準肽樣品:抑肽酶(6500 Da),牛血清蛋白(68000 Da),gly-gly-tyr-arg(451 Da),雙甘氨肽(132 Da),細胞色素C(12500 Da),桿菌肽(450 Da)。將出峰時間與標準品相對分子質量的對數值進行線性擬合,得到擬合方程y=-3.2389x+26.438(R2=0.9967),其中y為出峰時間,x為標準品相對分子質量的對數值。

1.2.4 沙棘蛋白氨基酸組成的測定 按GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》對凍干樣的水解氨基酸進行測定,略作修改[20-21]。

水解氨基酸的測定:樣品用6 mol/L鹽酸于110 ℃下水解24 h,水解后定容至50 mL,針管吸取約1 mL,0.22 μm濾膜過濾后裝入1 mL進樣瓶中由氨基酸自動分析儀進行測定。

1.2.5 沙棘蛋白中金屬含量的測定 采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS),參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》[22]。

1.2.6 模型小鼠的分組及灌胃處理方案 將db/db模型組隨機分為5組,m/m為正常對照組(Normal controls,NC),對小鼠進行耳號標記。進行灌胃實驗,灌胃時間為8周,給予普通飼料,飲用水為無菌純凈水,每次灌胃均為無菌純凈水0.5 mL。

第一組為m/m小鼠的正常對照組(NC);第二組為db/db小鼠2型糖尿病未治療對照組(DC),每日灌胃等量生理鹽水;第三組為db/db小鼠陽性對照組(PC),每日灌胃300 mg/kg鹽酸二甲雙胍懸浮液;第四組為db/db小鼠沙棘蛋白高劑量組(SSPH),第五組為db/db小鼠沙棘蛋白中劑量組(SSPM),第六組為db/db小鼠沙棘蛋白低劑量組(SSPL)，高中低劑量組每日灌胃沙棘蛋白分別為:200、100、50 mg/kg。

1.2.7 小鼠檢測指標

1.2.7.1 小鼠精神狀態的觀察、一級體重和血糖的測定 觀察小鼠的精神活動,毛發和飲食飲水情況,記錄小鼠適應性喂養1周后的初始體重W-0,以及灌胃1、4、8 w體重變化。

測量小鼠初始隨機血糖W-0,以及灌胃1、4、8 w后禁食8 h的空腹血糖,小鼠尾靜脈取血,用血糖儀和血糖試紙測定。

1.2.7.2 口服糖耐量實驗 口服糖耐量實驗(oral glucose tolerance tests,OGTTs)于實驗8周后進行。各組動物禁食12 h后尾靜脈取血測空腹血糖(FBG),之后給予相應的受試物,20 min后給予2.5 g/kg葡萄糖溶液,測定各組0.5、1、2 h時的血糖值,根據如下公式計算血糖曲線下面積GAUC[23]。

GAUC0～0.5h=(0 h血糖+0.5 h血糖)×0.25

GAUC0.5～2 h=(0.5 h血糖+1 h血糖×3+2 h血糖×2)×0.25

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 沙棘蛋白肽分子量、氨基酸和金屬含量

2.1.1 沙棘蛋白和肽分子量分布和氨基酸含量 經過堿溶酸沉處理得到的沙棘蛋白,其蛋白質含量為80%。由沙棘蛋白的肽分子量可知,沙棘蛋白組分中>10 kDa組分占26.14%,5～10 kDa組分占40.91%,1～5 kDa組分占17.95%,<1 kDa組分占15.00%,結果見表1。與其他植物蛋白,如大豆蛋白、玉米蛋白等相比[24],沙棘蛋白的溶解性較差,沙棘蛋白分子量明顯較小。

表1 沙棘蛋白肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of seabuckthorn seed protein peptide

圖1 沙棘蛋白肽分子量LC譜圖Fig.1 LC spectrum of the molecular weight of seabuckthorn seed protein peptide

由沙棘蛋白氨基酸分析結果可知,沙棘蛋白中氨基酸組成比較豐富,含有17種氨基酸,包括7種必需氨基酸(色氨酸被酸水解破壞,未測定),必需氨基酸(含胱氨酸和酪氨酸)總量為其氨基酸總量的21.16%。沙棘種仁蛋白中氨基酸總量為66.379%,與凱氏定氮結果接近。

表2 沙棘蛋白的氨基酸含量分析(g/100 g)Table 2 Content of amino acids in seabuckthorn seed protein(g/100 g)

其中,谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較高,分別為22.30%、15.37%和11.25%。精氨酸是維持嬰幼兒生長發育必不可少的氨基酸。它也是精子蛋白的主要成分,有促進精子生成,提供精子運動能量的作用。此外,靜注精氨酸,能刺激垂體釋放生長激素,可用于垂體功能試驗[25],因此沙棘蛋白可用于研發富集精氨酸的肽。研究表明,精氨酸調控NO在體內的合成,使得細胞具有足夠的抗氧化活性,同時富含精氨酸的膳食可以調節胰島細胞活性,增強GLUT4轉運子活性從而調節血糖水平,降低由于高血糖引起的心血管疾病,這是沙棘蛋白降血糖活性的物質基礎[26]。

2.1.2 沙棘蛋白金屬元素含量 由表3可知沙棘蛋白中鉛、砷、鎘、總汞、鉻等重金屬含量都遠遠低于國家標準要求[27],堿提酸沉鈉含量較高。鋅是300多種酶保持活性的必需微量元素[28],且鋅元素與甲狀腺功能密切相關[29]。血液中硒、銅、鎂、鐵、鋅等多種元素失衡的狀態容易增加代謝綜合征的風險[30],沙棘蛋白中銅、鎂、鐵、鈉、鋅、硒含量豐富,能夠補充人體所需微量元素,發揮預防代謝綜合征的作用。

表3 沙棘蛋白金屬元素含量Table 3 Contents of metal elements in seabuckthorn seed protein

2.2 沙棘蛋白改善二型糖尿病效果評價

2.2.1 小鼠一般狀態的觀察 正常組小鼠精神狀態活躍,飲食飲水正常,便尿量正常,體重穩定增長。糖尿病未治療組(DC)飲食飲水明顯增多,尿量多,眼神呆滯,毛發粗糙,甚至出現掉毛現象。糖尿病小鼠經二甲雙胍和沙棘蛋白治療后精神和飲食狀態有所改善,毛發順滑有光澤,墊料較為干燥。

2.2.2 沙棘蛋白對小鼠體重的影響 由圖2可知,NC組小鼠體重呈穩定增長的狀態,db/db各組的初始體重無顯著性差異(P>0.05)。實驗4周以后沙棘蛋白組體重及其增長速度都高于DC組,DC組較其他組出現了糖尿病多飲多食,體重增長緩慢的癥狀。實驗8周后,小鼠體重顯著低于PC和SSPH治療組(P<0.05)。沙棘蛋白處理組中SSPH對小鼠體重增長影響最大。糖尿病導致小鼠體重下降的影響與以往研究的結果一致[8],這一結果表明,沙棘蛋白可減輕糖尿病對小鼠造成的多飲多食多尿,體重增長緩慢的不良影響。

圖2 沙棘蛋白對糖尿病小鼠體重的影響Fig.2 The effect of seabuckthorn seed protein on the body weight of mice注:*表示與DC組相比有顯著性差異,P<0.05;#表示與PC組有顯著性差異,P<0.05;圖3同。

2.2.3 沙棘蛋白對小鼠血糖的影響 由實驗結果可知,NC組正常小鼠血糖值基本穩定在一定范圍內,db/db糖尿病各組小鼠的初始隨機血糖無顯著性差異(P>0.05),灌胃一周后的空腹血糖也無顯著性差異(P>0.05)。實驗進行四周后DC組血糖達到峰值28.06 mmol/L,相比于DC組,其他治療組血糖都顯著性下降(P<0.05),SSPL組降糖效果最優。治療8周后,與模型對照DC組的高血糖水平相比,沙棘蛋白在一定程度上抑制了糖尿病小鼠血糖的上升。實驗數據顯示小鼠血糖值未隨著實驗時間對沙棘蛋白呈現出一定的劑量依賴性,但是總體上與DC未治療組相比,血糖水平保持在較低水平。沙棘蛋白SSPM組和SSPL組降血糖效果優于SSPH組,結果見圖3。

圖3 沙棘蛋白對二型糖尿病小鼠血糖的影響Fig.3 The effect of seabuckthorn seed protein on the glucose values of mice

2.2.4 沙棘蛋白對小鼠血糖曲線下面積GAUC的影響 OGTTs是一種葡萄糖負荷試驗,用于了解機體對葡萄糖的調節和耐受性[31]?？诜咸烟悄土吭囼炛械目崭寡?FBG)主要反映夜間基礎胰島素的作用,餐后血糖是飲食作用后的反應,兩者都需要綜合分析[32]。此外血糖曲線下面積是一種反應血糖水平的指標,相較于單點的血糖值,血糖曲線下面積能更全面的分析血糖變化的時間和程度。由表4可知與FBG相比,血糖水平在0.5～1 h明顯升高到,在1 h達到峰值,根據GAUC計算,比重最大的是餐后1 h血糖。經過2 h的調節,血糖水平下降到穩定狀態。SSPL組在不同時間段血糖均顯著低于DC組(P<0.05)。NC組、PC組、SSPL組與DC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明,沙棘蛋白能明顯控制糖尿病小鼠的血糖,增強其調節血糖的能力,增強小鼠對血糖的耐受性。由表4可知,正常組NC的0～0.5 h血糖曲線下面積和0.5～2 h血糖曲線下面積顯著低于糖尿病組(P<0.05),糖尿病組DC的血糖曲線下面積顯著高于治療組(P<0.05),三個劑量組的沙棘蛋白的曲線下面積無顯著性差異(P>0.05),結果可知,沙棘蛋白可以提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性,減少葡萄糖的吸收。

表4 血糖曲線下面積(GAUC)Table 4 Blood glucose area under curve(GAUC)

3 結論

含量80%的沙棘蛋白氨基酸總量為66.379%,精氨酸含量較高,約占15.37%。沙棘蛋白含有人體所需的銅、鎂、鐵、鈉、鋅、硒等多種金屬元素。實驗證明沙棘蛋白低劑量組(50 mg/kg)對糖尿病小鼠降血糖效果最明顯;通過血糖曲線下面積可知,沙棘蛋白可明顯提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性,減少葡萄糖的吸收。沙棘蛋白能有效降低糖尿病小鼠的血糖和改善小鼠的精神狀態,減輕糖尿病對小鼠的損傷。