NCAM在成年大鼠視神經再生模型中的表達及分布與其再生作用研究

逄雨衡 楊家輝 劉稀羽

摘要：目的? 探討神經細胞黏附分子（NCAM）在成年大鼠視神經再生模型中的表達、分布及其在視神經再生中的作用。方法? 購置健康、雄性SD大鼠32只，隨機取SD大鼠8只設為空白對照組;剩余24只大鼠采用Aβ25-35寡聚體致傷SD大鼠海馬CA1區，建立阿茲海默癥（AD）動物模型，并構建大鼠視神經再生模型，建模成功后隨機分為模型對照組（n=8只）、NSCs移植組（n=8只）及NCAM1基因修飾神經干細胞（NSCs）移植組（n=8只）。空白對照組和模型對照組注入等體積的生理鹽水，NSCs移植組植入NSCs細胞，細胞數量3×105/L;NCAM1基因修飾NSCs移植組注入NCAM1基因修飾NSCs的細胞，細胞數量3×105/L，各組均完成7 d干預，比較各組學習和記憶能力、組織學檢測、海馬CAI區神經元形態、NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表達。結果? NCAM1基因修飾NSCs移植組潛伏期短于NSCs移植組和模型對照組，原平臺象限內停留時間、穿環次數均長（多）于NSCs移植組和模型對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;HE染色結果表明，NCAM1基因修飾NSCs移植組、NSCs移植組視神經損傷下對較輕，且NCAM1基因修飾NSCs移植組視神經損傷不明顯;NCAM1基因修飾NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植組和模型對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? NCAM在成年大鼠視神經再生模型中呈低表達，經NCAM基因修飾NSCs移植用于成年大鼠視神經再生模型中可提高NCAM的表達，有助于促進視神經再生。

關鍵詞：神經細胞黏附分子;視神經再生模型;視神經再生;神經干細胞;阿茲海默癥

Abstract：Objective? To investigate the expression and distribution of nerve cell adhesion molecule （NCAM） in the optic nerve regeneration model of adult rats and its role in optic nerve regeneration. Methods? 32 healthy and male SD rats were purchased， and 8 SD rats were randomly selected as a blank control group; the remaining 24 rats were injured by Aβ25-35 oligomers in hippocampal CA1 area of SD rats to establish Alzheimer's （AD） animal model， and build rat optic nerve regeneration model， after successful modeling， randomly divided into model control group （n=8）， NSCs transplantation group （n=8） and NCAM1 gene modified neural stem cells （NSCs） transplantation Group （n = 8）. The blank control group and the model control group were injected with equal volume of normal saline. The NSCs transplantation group was implanted with NSCs cells， the number of cells was 3×105/L; the NCAM1 genetically modified NSCs transplantation group was injected with NCAM1 genetically modified NSCs， and the number of cells was 3×105/L. Each group completed a 7 d intervention to compare the learning and memory abilities， histological examination， neuronal morphology of the hippocampal CAI area， NCAM， ERK1/2， JNK and P38 mRNA expressions in each group.Results? The latency of NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group was shorter than that of NSCs transplantation group and model control group. The residence time and the number of looping times in the original platform quadrant were both longer （more） than those of NSCs transplantation group and model control group，the differences were statistically significant （P<0.05）; HE staining results showed that： NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group， NSCs transplantation group had less optic nerve damage， and NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group had less obvious optic nerve injury; NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group NCAM， ERK1/2， JNK and P38 mRNA levels were higher than NSCs transplantation group and model control group， the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? NCAM has a low expression in the model of optic nerve regeneration in adult rats. Transplantation of NSCs modified with NCAM gene for the model of optic nerve regeneration in adult rats can increase the expression of NCAM and help promote the regeneration of optic nerve.

阿茲海默癥（AD）是一種以進行性認知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病[1]。目前臨床上對于AD病因尚未闡明，世界各國缺乏AD發生、延緩或阻止的有效方法和藥物[2]。因此，有效的藥物干預成為當前研究的熱點。研究表明[3]，中樞神經系統在損傷和退行性變后自身修復能力有限，而神經干細胞（NSCs）作為神經組織發育和自我修復的功能性細胞成為該領域研究的焦點。NSCs是一種具有分裂、增殖及定向分化潛能的細胞，對疾病、損傷具有反應能力[4]。同時，該細胞具有自我更新能力，能保證腦內細胞數量。既往研究表明[5]，NSCs移植用于AD中能進行激活、增殖與分化，從而形成具有功能的神經元，能治療海馬區功能障礙。而NSCs移植效果很大程度上取決于宿主神經元形成突觸連接并建立回路，且該方法難以克服局部致傷環境對移植細胞成功率的影響[6]。神經細胞黏附分子（NCAM）是一種細胞表面糖蛋白，廣泛存在于神經系統中，能直接參與海馬的突觸等神經生理功能[7]。基于此，本研究以健康、雄性SD大鼠為對象，探討NCAM在成年大鼠視神經再生模型中的表達及分布及其在視神經再生中的作用，報道如下。

1資料與方法

1.1實驗動物? 于2018年6月～2019年4月購置健康、雄性SD大鼠32只作為對象（購置于上海斯萊克實驗動物有限責任公司），動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005，體重180～220 g，平均體重（200.73±25.91）g。隨機取SD大鼠8只，設為空白對照組;剩余24只大鼠采用Aβ25-35寡聚體致傷SD大鼠海馬CA1區，建立AD動物模型，并構建大鼠視神經再生模型，建模成功后隨機分為模型對照組（8只）、NSCs移植組（8只）及NCAM1基因修飾神經干細胞（NSCs）移植組（8只）。小鼠實驗前適應性喂養1周，控制室內濕度40%～60%，溫度20～24℃。

1.2 儀器與設備? Trizol Reagent（美國Incitrogen公司）、miRNA RT-PCR試劑盒（上海生工生物）、酶標儀（芬蘭Thermo Labsystem公司）、臺式低溫離心機，型號：Eppendroff 5810R（德國）、ABIPRISM 7000HT熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、GOS7500型凝膠成像分析系統（美國UVP公司）、倒置顯微鏡（奧林巴斯公司）、化學發光凝膠成像系統（美國 Bio-rad 公司）、PBS（北京中杉金橋公司）、水迷宮（淮北正華生物儀器設備有限公司）。

1.3方法

1.3.1建模方法? 空白對照組建立后，取剩余24只大鼠，采用Aβ25-35寡聚體致傷SD大鼠海馬CA1區，建立AD動物模型，并構建大鼠視神經再生模型。Aβ25-35寡聚體制備：將Aβ25-35和六氟異丙醇（HFIP）提前放在冰盒上預冷，每1 mg Aβ25-35加入220 μl HFIP，該步驟在冰上操作。蓋上管蓋在室溫放置60 min，使Aβ25-35充分溶解。將溶解好的Aβ25-35放回冰上10 min后置于通風櫥內揮發、過夜[8]。次日打開通? 風櫥排風2 h。大體可見片狀沉淀。在超凈臺內向? ? ?其離心管加入44 μl二甲基亞砜，吹打混勻后，每 管加9386 μl無酚紅DMEM/F12培養基。4℃孵? ? 育24 h。隔日低溫離心機4 ℃、12000 r/min離心? 10 min后，轉移上清液至新管，分裝放入-20 ℃冰 箱儲存，儲存濃度為100 μmol/L，原子力顯微鏡鑒 定Aβ25-35寡聚體。大鼠適應1周后，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在立體 定向儀上。采用BAS立體定向儀，海馬定位參照Giovannelli等的方法。頭部備皮，常規消毒海，馬定位前囟后3.0 mm，中縫旁開2.0 mm，硬膜下2.9 mm。鉆開顱骨后，用微量進樣器5 min內緩慢注入Aβ25-35寡聚體5 μl，注射完畢后，針在里面停留25 min，緩慢拔出，然后用同樣的方法再注射另一側，縫合皮膚，預防感染;完成AD動物模型建立，并構建大鼠視神經再生模型[9]。

1.3.2動物干預? 空白對照組和模型對照組注入等體積的生理鹽水，NSCs移植組植入NSCs細胞，細胞數量3×105/L;NCAM1基因修飾NSCs移植組注入NCAM1基因修飾NSCs的細胞（將NSC細胞以3×105/孔的密度鋪至6孔板，AdNcam1以及AdGFP對照腺病毒分別以Mol=50的感染培養的NSCs），細胞數量3×105/L，各組均完成7 d干預。

1.4 觀察指標? ①學習和記憶能力：各組干預后7 d進行Morris水迷宮實驗，首先進行定位航行實驗，將大鼠從不同的象限置入水池中，記錄其游到水腫平臺上的時間（潛伏期）;對于60 s內未達到平臺，則將其引導到平臺上并停留5 s，將潛伏期記錄60 s，連續進行4 d實驗;第5 s撤走水中平臺，完成空間探索實驗。固定入水點，記錄60 s內在原平臺象限內停留時間及大鼠經原平臺位置的次數（穿環次數）[10];②組織學檢測：各組干預后7 d每組取大鼠4只，以斷頸方式處死，取各組視神經組織，石蠟包埋后常規制備4 μm切片，行HE染色，倒置顯微鏡下觀察組織形態[11]。③海馬CAI區神經元形態、NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表達：各組干預后7 d每組取大鼠4只，以斷頸方式處死，取各組海馬CAI區神經組織，采用實時熒光PCR法測定各組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表達水平[12]。

1.5統計學方法? 采用SPSS18.0軟件處理數據，計數資料采用[n（%）]表示，行？字2檢驗;計量資料采用（x±s）表示，行t檢驗， P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1四組學習和記憶能力比較? NCAM1基因修飾NSCs移植組潛伏期短于NSCs移植組和模型對照組，原平臺象限內停留時間、穿環次數均多于NSCs移植組和模型對照組（P<0.05）;NSCs移植組潛伏期短于模型對照組，原平臺象限內停留時間、穿環次數均多于模型對照組（P<0.05），見表1。

2.2四組HE染色比較? 空白對照組未參與建模，視神經組織未見損傷;模型對照組建模后未給予有效處理，視神經損傷較為明顯，伴有大量炎癥細胞;NCAM1基因修飾NSCs移植組、NSCs移植組視神經損傷下對較輕，且NCAM1基因修飾NSCs移植組視神經損傷不明顯，見圖1。

2.3四組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA比較? NCAM1基因修飾NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植組和模型對照組（P<0.05）;NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于模型對照組（P<0.05），見表2。

3討論

阿爾茨海默病是一種發病相對隱匿的、進行性發展的神經系統性疾病，臨床上以記憶障礙、視空間技能損害及執行功能障礙的為主，影響患者健康、生活。阿爾茨海默病病因復雜，其發病機制尚未完全常，主要具有神經細胞凋亡學說、內分泌失衡學說及神經細胞內鈣超載學說等，而神經突觸可塑性改變對阿爾茨海默病發生、發展的影響受到臨床重視[13]。近年來，隨著醫療技術的不斷發展，NSCs移植被認為是其中最直接最有效的方法，該細胞從胚胎或成年哺乳動物腦內、脊髓中分離培養出來，能分化為神經元、少突膠質細胞，具備自我更新能力，能保證腦內細胞數。

在本研究中，NCAM1基因修飾NSCs移植組潛伏期短于NSCs移植組和模型對照組（P<0.05）;原平臺象限內停留時間、穿環次數均多于NSCs移植組和模型對照組（P<0.05），說明NCAM1基因修飾NSCs移植能減輕AD大鼠視神經損傷，能延緩病情發展，有望成為AD新的靶點。NCAM1屬于是一種細胞表明糖蛋白，為細胞粘附分子，且多數存在于神經系統中，能直接參與海馬突觸等神經生理功能。既往研究表明，NCAM1能調節海馬突出的可塑性，能進行突觸性與結構維護，在發育期即可表達，對海馬神經的形態、功能發育具有重要的作用。臨床研究表明，在突觸塑形與維持突觸結構方面，NCAM1能發揮良好的促進作用，其具有較強的粘附能力，能調節細胞相關功能。本研究中，HE染色結果表明：NCAM1基因修飾NSCs移植組、NSCs移植組視神經損傷下對較輕，且NCAM1基因修飾NSCs移植組視神經損傷不明顯，說明NCAM基因修飾NSCs移植能減輕AD大鼠視神經損傷，可能與NCAM基因修飾后能增強NSCs干預作用，能發揮不同方法優勢。為了進一步分析NCAM基因修飾NSCs移植在AD大鼠中的作用，本研究中通過實時熒光PCR技術對其相關基因進程測定，結果顯示，NCAM1基因修飾NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植組和模型對照組（P<0.05），進一步驗證了NCAM基因修飾NSCs移植在AD大鼠中的作用，能改善AD大鼠視神經損傷。

綜上所述，NCAM在成年大鼠視神經再生模型中呈低表達，經NCAM基因修飾NSCs移植用于成年大鼠視神經再生模型中能提高NCAM表達，有助于促進視神經再生。

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收稿日期：2020-02-12;修回日期：2020-02-21

編輯/成森