三葉青藤葉配方顆粒的質量標準研究及其5種有效成分的含量測定

謝平 陳丹 洪麗婷 劉秀棉 余文靜 熊朝棟 廖淑彬 劉永靜

摘 要 目的：建立三葉青藤葉配方顆粒的質量標準，并同時測定其中5種有效成分的含量。方法：采用薄層色譜法（TLC）對三葉青藤葉配方顆粒中綠原酸、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷進行定性鑒別。采用紫外分光光度法測定3批樣品中總黃酮（以異葒草苷計）含量，并對其粒度、水分、溶化性及裝量差異進行檢查。以異葒草苷為內參物計算其余成分的相對校正因子，采用一測多評法測定樣品中新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷的含量，并與外標法測定結果進行比較。結果：綠原酸、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。樣品中異葒草苷檢測質量濃度的線性范圍為7.73～61.82 μg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率為93.75%～97.85%（RSD=1.41%，n=6）。3批樣品不能通過一號篩且能通過五號篩的平均百分率分別為1.51%、1.55%、1.29%（n=3），含水量分別為4.63%、5.18%、4.03%（n=3）;顆粒均在5 min內溶化;裝量差異為4.8%～5.0%，均符合2015年版《中國藥典》（四部）顆粒劑的相關規定。一測多評法測定5種成分質量濃度的線性范圍分別為2.325～93 μg/mL（r=0.999 9）、5.125～205 μg/mL（r=0.999 9）、1.150～46 μg/mL（r=0.999 3）、2.625～105 μg/mL（r=0.999 9）、4.725～189 μg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3%;加樣回收率分別為99.78%～106.13%（RSD=2.33%，n=6）、95.07%～103.32%（RSD=2.72%，n=6）、97.17%～105.43%（RSD=2.98%，n=6）、95.52%～101.33%（RSD=2.46%，n=6）、99.42%～105.56%（RSD=2.34%，n=6）。異葒草苷相對于新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷的相對校正因子分別為0.731、0.805、0.821、0.590;一測多評法測得5種成分的含量分別為0.828～1.123、2.379～3.118、0.281～0.880、1.039～1.393、2.121～3.209 mg/g，外標法測得的含量分別為0.803～1.099、2.345～3.085、0.269～0.872、1.039～1.393、2.113～3.201 mg/g;兩種方法測定結果比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：所建質量標準簡便、快速，可用于三葉青藤葉配方顆粒的質量控制;所建一測多評法準確、高效，可用于同時測定三葉青藤葉配方顆粒中5種有效成分的含量。

關鍵詞 三葉青藤葉配方顆粒;質量控制;薄層色譜法;紫外分分光光度法;一測多評法;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the quality standard of Tetrastigma hemsleyanum stem and leaves dispensing granules， and to determine the contents of 5 active ingredients simultaneously. METHODS： Chlorogenic acid， isoorientin and isoorientin-2′-O-rhamnoside in T. hemsleyanum stem and leaves dispensing granules were identified by TLC. The total flavonoids of the 3 batches granules were determined by UV spectrophotometry （by isoorientin）. The granule sizes， moisture contents， dissolvability， and content uniformity were determined. Using isoorientin as internal reference， relative correction factors of other components were established. QAMS method was adopted to determine the contents of neochlorogenic acid， chlorogenic acid， orientin， isoorientin and isoorientin-2′-O-rhamnoside， which were compared with the results of ESM method. RESULTS： TLC spots of chlorogenic acid， isoorientin and isoorientin-2′-O-rhamnoside were clear and well-separated， without interference from negative control. The linear range of isoorientin were 7.73-61.82 μg/mL（r=0.999 9）. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 93.75%-97.85%（RSD=1.41%， n=6）.? The average percentages that the 3 batches granules could not pass through sieve No. 1 but No.5 were 1.51%， 1.55% and 1.29%（n=3）. The average moisture contents were 4.63%， 5.18% and 4.03%（n=3）. All were dissolved within 5 min ， and content uniformity were 4.8%-5.0%. Which were all in line with the relevant provi- sions of granules in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （volume Ⅳ）. The linear range of 5 ingredients were 2.325-93 μg/mL（r=0.999 9）， 5.125-205 μg/mL（r=0.999 9）， 1.150- 46 μg/mL（r=0.999 3）， 2.625-105 μg/mL（r=0.999 9）， 4.725-189 μg/mL（r=0.999 9）， respectively. RSD of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The recoveries were 99.78%-106.13%（RSD=2.33%，n=6）， 95.07%-103.32%（RSD=2.72%，n=6）， 97.17%-105.43%（RSD=2.98%，n=6）， 95.52%-101.33%（RSD=2.46%，n=6）， 99.42%-105.56%（RSD=2.34%，n=6）. Using isoorientin as internal reference， relative correction factors of neochlorogenic acid， chlorogenic acid， isoorientin and isoorientin-2′-O-rhamnoside were 0.731， 0.805， 0.821， 0.590， respectively. The contents were 0.828-1.123， 2.379-3.118， 0.281-0.880， 1.039-1.393， 2.121-3.209 mg/g by QAMS method， while the contents were 0.803-1.099， 2.345-3.085， 0.269-0.872， 1.309-1.393， 2.113-3.201 mg/g by ESM method， there was no significant difference in the content determination results between QAMS and ESM method （P>0.05）. CONCLUSIONS： Established quality standard is simple and rapid， and can be used for quality control of T. hemsleyanum stem and leaves dispensing granules. Established QAMS method is accurate and efficient， and it can be used for simultaneous determination of 5 active ingredients of T. hemsleyanum stem and levels dispensing granules.

2.1.4 溶化性檢查 取3批三葉青藤葉配方顆粒，每批3袋，分別加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察其溶化情況，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“0104顆粒劑”[10]項下方法測定溶化性。結果，3批樣品均在5 min內全部溶化，無肉眼可見雜質與異物，無焦屑，符合2015年版《中國藥典》（四部）顆粒劑項下規定[10]。

2.1.5 裝量差異檢查 取3批三葉青藤葉配方顆粒，每批10袋，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“0104顆粒劑”[10]項下方法測定裝量差異。結果，3批樣品的裝量差異為4.8%～5.0%，符合2015年版《中國藥典》（四部）顆粒劑項下規定限度要求[10]。

2.2 三葉青藤葉配方顆粒中總黃酮的含量測定

基于化學成分分析及已建立的三葉青藤葉飲片及湯劑中總黃酮含量的測定方法，選取三葉青藤葉配方顆粒中含量較高且較易獲得的成分異葒草苷為對照，采用UV法測定其含量[7，9]。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取異葒草苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度為0.193 2 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取三葉青藤葉配方顆粒約0.2 g，置于25 mL量瓶中，加30%甲醇超聲使溶解，冷卻至室溫后，用30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 精密稱取缺三葉青藤葉的陰性配方顆粒（由福建中醫藥大學藥學院自制），按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.4 顯色方法及檢測波長的選擇 取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各0.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇補足至6 mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min;于200～800 nm波長范圍內掃描。結果，對照品溶液及供試品溶液顯色后均在500 nm波長處有最大吸收，陰性對照無干擾，故確定檢測波長為500 nm，詳見圖2。

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2.4”項下方法顯色后，以空白溶劑顯色體系為參比，于500 nm波長處測定吸光度。以質量濃度（c，μg/mL）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸。結果，異葒草苷的回歸方程為A=1.41×10-2c-4.30×10-3（r=0.999 9），異葒草苷檢測質量濃度的線性范圍為7.73～61.82 ?g/mL。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液3.0 mL，按“2.2.4”項下方法顯色后，于500 nm波長處重復測定6次。結果，吸光度的RSD為 0.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20170726）適量，按“2.2.4”項下方法顯色后，分別于室溫下放置0、5、10、15、20、 25、30 min時，于500 nm波長處測定吸光度。結果，吸光度的RSD為0.44%（n=7），表明供試品溶液在室溫下顯色后30 min內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取樣品（批號：20170726），約0.2 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下方法顯色后，于500 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品含量。結果，總黃酮的平均含量為66.20 mg/g，RSD 為1.07%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號：20170726），約0.1 g，共6份，分別精密加入異葒草苷對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下方法顯色后，于500 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結果見表1。

2.2.10 樣品含量測定 取3批樣品，約0.2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，取上述供試品溶液0.5 mL，按“2.2.4”項下方法顯色后，于500 nm波長處測定吸光度。每批樣品平行測定3次，按標準曲線法計算樣品中總黃酮的含量，結果見表2。

2.3 QAMS法同時測定三葉青藤葉配方顆粒中5種成分的含量

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷對照品適量，加甲醇超聲使溶解，冷卻至室溫后，用甲醇制成上述5種成分質量濃度分別為0.093、0.205、0.046、0.105、0.189 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 同“2.2.3”項。

2.3.4 色譜條件 色譜柱：250-4 Lichrocart C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，20%A;10～15 min，20%A→25%A;15～20 min，25%A→33.5%A;20～23 min，33.5%A;23～30 min，33.5%A→40%A;30～40 min，40%A→20%A）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：340 nm;柱溫：40 ℃;進樣量：10 μL。

2.3.5 專屬性試驗 分別精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各色譜峰分離度良好，均大于1.5;理論板數按綠原酸峰計不低于3 000;陰性對照無干擾，詳見圖3。

2.3.6 線性關系考察 精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，按“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表3。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.1”項下混合對照品溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.3.4”項下色譜條件連續測定6次，記錄峰面積。結果，新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2′- O-鼠李糖苷峰面積的RSD分別為2.27%、0.39%、0.42%、0.59%、0.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液（批號：20170726）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時，按“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷峰面積的RSD分別為2.99%、0.31%、0.91%、0.26%、0.27%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.3.9 重復性試驗 精密稱取樣品（批號：20170726）約0.2 g，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按ESM法計算樣品中5種成分的含量。結果，新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷的平均含量分別為1.073、2.628、0.830、1.397、2.118 mg/g，RSD分別為1.45%、2.59%、2.65%、2.77%、2.63%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號：20170726）約0.1 g，共6份，分別精密加入“2.3.1”項下混合對照品溶液1 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表4。

2.3.11 QAMS設計與內參物的選擇 選擇含量相對較高且對照品較易得到的活性成分異葒草苷為內參物，根據標準曲線斜率的比值計算相對校正因子[11-12]，并通過線性回歸擬合排除偏差，建立同時測定樣品中5種成分含量的QAMS法。在一定線性范圍內，成分的質量或濃度（W）與檢測器響應值（A）成正比，即W=f·A（f表示相對校正因子）[11-12]。按上述公式計算內參物異葒草苷與其余成分的相對校正因子，再通過校正因子計算含量。Cm=Am/（ak·fm/k）（式中，Cm為其余成分質量濃度，Am為其余成分峰面積，ak為內參物異葒草苷標準曲線斜率，fm/k為相對校正因子）;fm/k=am（式中，am為其余成分標準曲線斜率）。

2.3.12 相對校正因子的計算 以異葒草苷為內參物，按“2.3.11”項下公式計算新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷對內參物異葒草苷的相對校正因子。結果，上述4種成分的相對校正因子分別為0.731、0.805、0.821、0.590。

2.1.13 QAMS法與ESM法測定結果比較 取3批樣品，分別按QAMS法、ESM法測定其中5種成分的含量，采用SPSS 20.0軟件以Pearson相關系數評價兩種方法測得結果的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。結果，QAMS法與ESM法的測定結果呈正相關，結果組間比較差異無統計學意義（P>0.05），提示所建的QAMS法結果準確、可靠，可用于配方顆粒中5種有效成分的含量測定，詳見表5。

3 討論

本研究參考相關文獻[9]，采用聚酰胺薄膜以三葉青藤葉中含量較高的有效成分綠原酸、異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷為對照進行TLC鑒別。筆者分別比較了正丁醇-乙醇-水（6 ∶ 35 ∶ 59，V/V/V）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5 ∶ 5 ∶ 4 ∶ 0.6，V/V/V/V）、三氯甲烷-丙酮-無水乙醇-水（4 ∶ 3 ∶ 3.6 ∶ 0.4，V/V/V/V）、乙酸乙酯-乙醇-水-冰醋酸（6 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.2，V/V/V/V）、三氯甲烷-丙酮-冰乙酸-無水乙醇（4 ∶ 1 ∶ 3 ∶ 2，V/V/V/V）、三氯甲烷-丙酮-冰乙酸-無水乙醇（4 ∶ 1 ∶ 3 ∶ 2，V/V/V/V）、36%乙酸溶液等為展開劑系統的分離效果。結果顯示，當以36%乙酸溶液為展開劑時，各成分斑點分離效果最佳，陰性對照無干擾。同時，本研究對三葉青藤葉配方顆粒的粒度、水分、溶化性和裝量差異等方面進行了檢查。結果顯示，其粒度、含水量、溶化性及裝量差異均符合2015年版《中國藥典》（四部）顆粒劑項下的相關規定[10]。

三葉青藤葉中含有的異葒草苷、異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷等黃酮類成分是其主要藥效成分[7-8]。本研究采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，以含量較高、峰面積較大且穩定的活性成分異葒草苷為對照，經顯色后于500 nm波長處進行檢測。結果顯示，供試品和對照品于500 nm波長處均有最大吸收。測得3批三葉青藤葉配方顆粒中總黃酮含量為63.78～67.30 mg/g。

在前期預試驗中，筆者通過比較二極管陣列紫外檢測器在200～600 nm波長掃描下的色譜圖發現，當檢測波長為340 nm時，樣品中5種待測成分色譜峰的分離良好、峰面積較大，故選擇340 nm為QAMS法的檢測波長。同時，筆者又比較了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.5%甲酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動相系統在等度洗脫及梯度洗脫條件下的分離效果。結果顯示，以甲醇-0.5%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各成分色譜峰分離良好且基線平穩。

采用ESM法同時測定樣品中5種成分的含量時需要5種對照品，而異葒草苷-2′-O-鼠李糖苷、葒草苷等對照品較難獲得且成本較高，采用QAMS法可以避免這些不足;同時，由于綠原酸有異構體，其穩定性相對較差，故本研究以含量較高的活性代表成分異葒草苷為內參物，采用QAMS法同時測定了三葉青藤葉配方顆粒中5種成分的含量，并與ESM法進行比較。結果顯示，QAMS法與ESM法的測定結果比較差異無統計學意義，可達到同時測定配方顆粒復雜體系中多指標含量的目的。

綜上所述，本研究所建的質量標準簡便、快速，可用于三葉青藤葉配方顆粒的質量控制;所建含量測定方法準確、高效，可用于同時測定三葉青藤葉配方顆粒中5種成分的含量。

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（收稿日期：2019-08-27 修回日期：2020-01-29）

（編輯：陳 宏）