不同生長年限三七花的指紋圖譜建立及其人參皂苷的含量比較研究

黃再強 朱琳 高明菊 馮光泉 馬小雙 常征

摘 要 目的：比較不同生長年限三七花的化學成分類別及人參皂苷含量的差異，探討生長年限對三七花品質的影響。方法：收集2年生、3年生、4年生三七花樣品各10批，采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。色譜柱為Shim-pack GIST C18，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脫），柱溫為30 ℃，流速為0.5 mL/min，檢測波長為203 nm，進樣量為20 μL。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》繪制30批樣品的指紋圖譜并指認特征成分，同時進行相似度分析;采用SPSS 22.0軟件對樣品進行聚類分析。采用上述HPLC法對不同生長年限三七花共30批樣品中的人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc進行含量測定;采用SPSS 22.0軟件進行質量控制分析。結果：所建指紋圖譜的精密度、穩定性、重現性均良好;含量測定方法線性關系（R 2>0.999）、定量限、精密度、穩定性、重復性、準確度均良好。通過指紋圖譜指認了不同生長年限三七花中人參皂苷Re、R1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3等6個共有成分以及3年生三七花樣品中的人參皂苷Rd;2年生、3年生、4年生三七花各10批樣品指紋譜圖在同一年限樣品間比較的平均相似度分別為0.881、0.952、0.945，不同生長年限樣品之間進行比較的相似度也均不低于0.817。30批三七花樣品可聚為4個類別，第Ⅱ類均為4年生樣品，第Ⅲ類均為3年生樣品，第Ⅰ、Ⅳ類多為2年生樣品以及少量3年生、4年生樣品。2年生樣品中4種人參皂苷成分含量及總含量的RSD為8.90%～21.43%，總皂苷含量為11.65%～17.76%;3年生樣品中上述成分含量及總含量的RSD為6.45%～14.23%，總皂苷含量為15.74%～19.30%;4年生樣品中上述成分含量及總含量的RSD為7.50%～18.86%，總皂苷含量為15.92%～20.16%。質量控制分析結果顯示，2年生樣品主要分布在Ⅱ、Ⅲ類區域，3年生、4年生樣品主要分布在Ⅰ、Ⅱ類區域，人參皂苷成分的含量大小排序為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ。結論：不同生長年限三七花的化學成分類別大體接近，但仍存在一定差異，其中2年生樣品中人參皂苷類成分含量較低、波動較大，整體品質略差;3年生、4年生樣品中人參皂苷類成分含量更高、波動相對更小，整體品質較高且趨于穩定。

關鍵詞 三七花;生長年限;高效液相色譜法;指紋圖譜;人參皂苷;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare chemical composition types and ginsenoside content of Panax notoginseng flowers with different growing years， and to explore the effect of growing year on the quality of P. notoginseng flowers. METHODS： Each 10 batches of biennial， triennial and quadrennial P. notoginseng flower were collected and determined by HPLC. The determination was performed on Shim-pack GIST C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelength was set at 203 nm. The sample size was 20 μL. Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint was used to establish the fingerprint of 30 batches of samples， identify the diagnostic components and analyze the similarity. Cluster analysis was conducted by using SPSS 22.0 software. The contents of ginsenoside Rb1， Rb2， Rb3 and Rc in 30 batches of P. notoginseng flower with different growing years were determined by above HPLC. The quality control analysis was conducted by using SPSS 22.0 software. RESULTS： Established fingerprint showed good precision， stability and reproducibility. There were good linear relationship （R 2>0.999）， quantitative limit， precision， stability， repeatability and accuracy of the content determination method. Six common components as ginsenoside Rb1， Rb2， Rb3 and Rc were identified in P. notoginseng flower with different growing years by fingerprint; ginsenoside Rd was identified in triennial P. notoginseng flower. The similarities of the fingerprints among 10 batches of biennial， triennial and quadrennial P. notoginseng flower were 0.881， 0.952 and 0.945， respectively. The similarity among samples with different growing years was more than 0.817. Thirty batches of P. notoginseng flower could be grouped into 4 categories， the category Ⅱ was quadrennial samples， the category Ⅲ was triennial samples， while the categories Ⅰ and Ⅳ were mostly biennial samples and a small number of triennial and quadrennial samples. RSDs of 4 ginsenosides contents and their total contents in biennial samples were 8.90%-21.43% and total saponin contents were 11.65%-17.76%， respectively. RSDs of 4 ginsenosides contents and their total contents in triennial samples were 6.45%-14.23%， and total saponin contents were 15.74%-19.30%. RSDs of 4 ginsenosides contents and their total contents in quadrennial samples were 7.50%-18.86%， and total saponin contents were 15.92%-20.16%. The results of quality control analysis showed that biennial samples mainly distributed in the areas of Ⅱ and Ⅲ; triennial and quadrennial samples mainly distributed in the areas of Ⅰ and Ⅱ; the order of ginsenosides content was Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ. CONCLUSIONS： Chemical components of P. notoginseng flower with different growing years are generally close in types but there still are some differences， among which the content of ginsenosides in biennial samples is lower， fluctuates more， and the overall quality is slightly poor; the content of ginsenosides in triennial and quadrennial samples is higher， fluctuates less， and the overall quality is higher and tends to be stable.

KEYWORDS? ?Panax notoginseng flowers; Growing year; HPLC; Fingerprint; Ginsenosides; Content determination

三七花是傳統名貴中藥五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen]的干燥花蕾，其性味甘涼，具有清熱、平肝、降壓之功效，有較好的藥用價值和保健作用[1]。三七在第1年生長期一般不開花（偶有出現“夢花”），第2年起正常開花，目前市場上以2年生、3年生、4年生三七花為主。有關三七花化學成分的研究報道較多，主要集中在人參皂苷Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd等成分的含量測定[2-3]，也可見三七花與其他五加科人參屬花的鑒別研究[1，4-6]。但關于不同年限三七花中化學成分及其質量差異的研究報道較少。有學者研究發現，2年生、3年生三七花在成分類別及其含量上存在較大差異[7]，但研究報道中三七花樣本量偏小。為了全面系統地研究不同生長年限三七花在化學成分類別及人參皂苷含量上的差異，本課題組收集了2年生、3年生、4年生三七花共計30個批次的樣品，通過高效液相色譜法（HPLC）建立其指紋圖譜并進行多個指標成分（人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc）的含量測定，以期綜合比較生長年限對三七花品質的影響。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030型HPLC儀（日本Shimadzu公司）;BP121S型萬分之一電子分析天平、BP211D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）;SQP型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];SB-3200DTD型超聲儀（寧波新藝超聲設備有限公司）;DFY-500D型粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

2年生、3年生、4年生三七花樣品各10批（均為2018年6-10月采收的三七花）和加樣回收率試驗用樣品1批（批號：WS-1，于2018年2月采收的三七花），均購自文山市三七國際交易中心，產地主要為文山當地及周邊地區。樣品經云南農業大學農學與生物技術學院文國松副研究員、文山學院三七學院黃再強助教鑒定為五加科人參屬三七[P. notoginseng（Burk）F. H. Chen]的干燥花蕾，并在參考采樣記錄的基礎上，通過花蕾的大小、顏色等性狀確定了其生長年限。2018年6-10月采收的30批三七花樣品信息詳見表1。

人參皂苷Re（批號：MUST-18032502，純度：≥98.00%）、人參皂苷R1（批號：MUST-14042810，純度：≥99.52%）、人參皂苷Rd（批號：MUST-18032202，純度：≥98.00%）、人參皂苷Rb2（批號：MUST-18032302，純度：≥99.32%）、人參皂苷Rb3（批號：MUST-17042812，純度：≥99.65%）、人參皂苷Rc（批號：MUST-18042803，純度：≥98.00%）等對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司;人參皂苷Rb1對照品（北京世紀奧科生物科技有限公司，批號：C54H92023，純度：≥98.00%）;乙腈、磷酸均為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 不同年限三七花HPLC指紋圖譜研究

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取人參皂苷Re、R1、Rd、Rc、Rb1、Rb2、Rb3對照品各適量，加50%乙醇溶解制成每1 mL分別含上述成分0.51、0.45、0.41、0.87、0.81、0.75、0.84 mg的單一對照品溶液，4 ℃低溫保存，備用。

2.1.2 供試品溶液 將三七花樣品粉碎成粗粉，取樣品粉末1 g，置于150 mL錐形瓶中，加入50%乙醇100 mL，稱定質量，超聲（頻率：40 kHz，功率：200 W）提取40 min，冷卻至室溫后，再次稱定質量，加50%乙醇補足減失質量，以16層錐形濾紙（底部塞有脫脂棉）濾過，取續濾液，即得供試品溶液，于4 ℃保存，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，3%A;8 min，10%A;20 min，25%A;30 min，36%A;60 min，36%A）;柱溫：30 ℃;流速：0.5 mL/min;檢測波長：203 nm;進樣量：20 ?L。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.1.1”項下人參皂苷Rb3單一對照品溶液（該成分在三七花中含量相對較高，故用來進行方法學考察，下同）適量，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。結果，各色譜峰峰面積的RSD≤0.35%、保留時間的RSD≤0.38%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取供試品溶液（批號：S3-1）適量，分別于室溫下放置0、8、16、24 h時，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在26～45 min保留時間內（這一時間段色譜圖上特征峰出峰較多，下同），各色譜峰峰面積的RSD≤0.35%、保留時間的RSD≤0.30%（n=4）;同時，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版A）》進行相似度分析，結果不同時間點各色譜圖的相似度≥0.97，表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取三七花樣品粉末（批號：S3-1）1 g，平行6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在26～45 min保留時間內，各色譜峰峰面積的RSD≤0.30%、保留時間的RSD≤0.22%（n=6）;同時，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版A）》進行相似度分析，結果不同樣品各色譜圖的相似度≥0.98，表明本方法重復性良好。

2.4 不同年限三七花 HPLC指紋圖譜生成與相似度分析

取不同生長年限的30批三七花樣品粉末各1 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將不同批次三七花樣品的色譜圖AIA格式文件導出，依次全譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012版A）》中，生成指紋圖譜的共有模式（R），即對照指紋圖譜（見圖1），再經軟件處理后建立不同生長年限三七花各10批樣品的疊加指紋圖譜（見圖2），同時進行相似度分析。

相似度分析結果顯示，2年生、3年生、4年生三七花樣品的指紋譜圖在同年限10批間進行比較的相似度分別≥0.823、≥0.847、≥0.830，平均相似度分別為0.881、0.952、0.945。這表明，同一生長年限的三七花樣品之間的化學成分類別較為一致，相對較穩定。不同生長年限樣品之間進行比較的結果顯示，2年生與3年生樣品之間相似度≥0.825，2年生與4年生樣品之間相似度≥0.817，3年生與4年生樣品之間相似度≥0.865。這表明，不同生長年限三七花樣品中化學成分類別大體接近，但仍存在一定差異。

2.5 不同生長年限三七花樣品HPLC指紋圖譜特征峰的指認

根據采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版A）》對不同生長年限三七花各10批樣品的色譜圖處理分析后生成的各生長年限三七花樣品的對照指紋圖譜（見圖1），確認了各生長年限三七花樣品的36個共有色譜峰，并通過比各單一對照品溶液的主峰保留時間，指認了不同生長年限三七花中共有的人參皂苷Re、R1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3等6個共有成分以及3年生三七花樣品中的人參皂苷Rd。

由圖1可見，2年生三七花樣品中大部分色譜峰面積都較3年生、4年生三七花樣品小;2年生、4年生三七花色譜圖中都有很小的5號峰，而在3年生三七花中未見該色峰;與3年生三七花比較，4年生三七花色譜圖中6、7、18、32、37號峰有變小的趨勢。各年限三七花的成分種類較為一致，而各成分峰面積大小存在明顯差異，3年生、4年生三七花樣品的對照指紋圖譜中色譜峰數目較多、峰面積較大，而2年生三七花樣品對照指紋圖譜中色譜峰數目略少、峰面積較小。根據對照指紋圖譜可以初步認為，3年生、4年生三七花樣品中各成分含量相對較高，2年生樣品各成分含量略低。

2.6 不同生長年限三七花樣品指紋圖譜的聚類分析

采用SPSS 22.0軟件對不同生長年限三七花樣品的原始指紋圖譜進行聚類分析，以平方歐式距離作為樣品的測度，以Ward 連接法進行聚類，結果見圖3。聚類分析結果顯示，30批三七花樣品可聚為4個類別，其中第Ⅱ類均為4年生三七花樣品，第Ⅲ類均為3年生三七花樣品，而第Ⅰ、Ⅳ類多為2年生三七花樣品以及少量3年生、4年生三七花樣品。

3 不同生長年限三七花樣品中4種人參皂苷的含量測定

基于30批三七花樣品的指紋圖譜研究結果及已有相關對照品，本研究選擇色譜峰面積相對較大、含量相對較高的人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等4種成分進行含量測定，比較不同生長年限三七花樣品中上述成分的含量差異。

3.1 溶液的制備

3.1.1 對照品溶液 精密稱取人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc對照品各適量，加50%乙醇溶解制成每1 mL分別含上述成分0.551、0.475、0.510、0.530 mg的單一對照品溶液，4 ℃低溫保存，備用。

3.1.2 供試品溶液 按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于4 ℃保存，備用。

3.2 色譜條件及系統適用性試驗

采用“2.2”項下色譜條件進樣測定。取“3.1.2”項下供試品溶液（批號：S3-1）進樣測定，記錄色譜圖（見圖4），并與“3.1.1”項下單一對照品溶液和空白溶劑色譜圖（圖略）進行對比。結果，理論板數以人參皂苷Rb3計不低于6 000，4種待測人參皂苷的色譜峰分離度均大于1.5，空白溶劑無干擾，表明本色譜條件系統適用性良好。

3.3 方法學考察

3.3.1 線性關系與定量限考察 取“3.1.1”項下人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc各單一對照品溶液，經0.45 ?m 微孔濾膜濾過，按“3.2”項下色譜條件分別進樣4、8、12、16、20、24、28 ?L，以峰面積（y）為縱坐標、進樣量（x，?g）為橫坐標進行線性回歸。結果，上述4種人參皂苷在相應進樣量范圍內與峰面積線性關系良好（R 2>0.999）。各待測成分的回歸方程及線性范圍見表2。

3.3.2 精密度試驗 取“3.1.1”項下人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc各單一對照品溶液，按“3.2”項下色譜條件分別進樣測定5次，記錄色譜圖。結果，上述待測成分峰面積的RSD分別為0.22%、0.23%、0.18%、0.24%（n=5），表明儀器精密度良好。

3.3.3 穩定性試驗 取三七花供試品溶液（批號：S3-1）適量，經0.45 ?m微孔濾膜濾過后，分別在室溫下放置0、8、16、24 h時，按“3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc峰面積的RSD分別為0.21%、0.25%、0.15%、0.26%（n=4），表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h內穩定性良好。

3.3.4 重復性試驗 取三七花樣品粉末（批號：S3-1）1 g，平行6份，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，經0.45 ?m微孔濾膜濾過后，按“3.2”項下色譜條件進樣測定。采用標準曲線法計算人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc的含量。結果，上述待測成分的平均含量分別為3.56%、5.01%、7.64%、4.33%，RSD分別為0.22%、0.23%、0.16%、0.24%（n=6），表明該方法重復性良好。

3.3.5 加樣回收率試驗 取已知含量的三七花樣品粉末（批號：WS-1，人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc的含量經測定分別為1.77%、2.50%、3.81%、2.15%）0.1 g，平行6份，分別按質量比為1 ∶ 1加入人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc各對照品，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，經0.45 ?m微孔濾膜濾過后，再按“3.1”項下色譜條件進樣測定。采用標準曲線法計算上述待測成分的含量并計算加樣回收率。結果，上述待測成分的平均加樣回收率分別為98.85%、98.87%、99.83%、100.74%（RSD均小于4%，n=6），表明該方法準確性良好，詳見表3。

3.4 樣品含量測定

取30批三七花樣品粉末各1 g，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，經0.45 ?m微孔濾膜濾過后，按“3.2”項下色譜條件進樣測定，采用標準曲線法計算人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc的含量及其總含量。平行3份操作，取平均值，結果見表4。

由表4可見，2年生三七花樣品中4種人參皂苷成分含量及總含量的RSD為8.90%～21.43%，總皂苷含量為11.65%～17.76%;3年生三七花樣品中上述成分含量及總含量的RSD為6.45%～14.23%，總皂苷含量為15.74%～19.30%;4年生三七花樣品中上述成分含量及總含量的RSD為7.50%～18.86%，總皂苷含量為15.92%～20.16%。結果表明，與2年生三七花比較，3年生、4年生樣品中4種人參皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc）的總含量更高，含量波動相對更小，提示三七花生長至第3、4年時各成分逐漸趨于穩定。

3.5 不同生長年限三七花樣品多指標成分含量的質量控制分析

采用SPSS 22.0統計軟件，對不同生長年限三七花共30批樣品中人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc的總含量進行質量控制分析，并根據分析結果將30批樣品分為3類區域，結果見圖5。結果顯示，2年生三七花樣品主要分布在Ⅱ、Ⅲ類區域，3年生、4年生三七花樣品主要分布在Ⅰ、Ⅱ類區域，人參皂苷成分的含量大小排序為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ，表明3年生、4年生三七花的品質相對較高，2年三七花品質略差。

4 討論

本研究建立了不同生長年限三七花的HPLC指紋圖譜，并選擇含量相對較高的人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc為指標，建立了同時測定上述4種成分的含量測定方法，以比較研究了不同生長年限三七花樣品化學成分類別及含量，從而評價其品質差異。相比文獻方法[6]，本研究建立的三七花HPLC指紋圖譜分析時間縮短，且色譜峰峰形明顯改善、色譜峰數明顯增加，能更為完整地體現三七花的化學成分的整體特征;同時，所建立的含量測定方法能同時測定三七花中人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等4種成分，方法簡便可行，精密度、準確度、穩定性均良好。

綜合比較不同生長年限三七花樣品的HPLC指紋圖譜和4種人參皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc）的含量測定結果后發現，各生長年限樣品的化學成分類別大體接近但仍存在一定差異，其中2年生樣品的人參皂苷類成分含量較低、波動較大，整體品質略差;而相對而言，3年生、4年生樣品的人參皂苷類成分含量更高、波動更小，整體品質較高、趨于穩定。筆者推測，生長年限對三七花成分含量的影響可能是由于在2年生長期時，三七的植物吸收和代謝系統才基本形成，此時植物需要大量吸收營養成分以促進生長，且生長主要集中在根部，因此提供給花、莖、葉的養分較少;而到了第3、4年生長期時，三七根部生長趨勢減慢，植物代謝系統較為發達，提供給三七花、莖、葉的養分增加，故其相應化學成分含量逐漸增加[8]。

由于本研究受項目條件等限制，本課題組獲得的對照品類別有限，故本次試驗僅指認了不同生長年限三七花樣品中人參皂苷Re、R1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3等6個共有成分以及3年生三七花樣品中的人參皂苷Rd，并對含量相對較高的人參皂苷成分Rb1、Rb2、Rb3、Rc進行了定量檢測，而色譜圖中峰面積最大的16、18、25號等色譜峰尚未能指認，也未能進行含量測定。因此，在下一步研究中，本課題組擬通過擴大對照品來源等手段，進一步對16、18、25號等色譜峰進行指認，并增加相應含量測定指標，以深入研究和綜合評價不同生長年限三七花的品質。

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（收稿日期：2019-04-20 修回日期：2020-03-10）

（編輯：段思怡）