Slit2蛋白在早期宮頸鱗癌中的表達及意義

朱偉艷 劉田雨 劉永珠 張欣寧 姚書忠

【摘要】 目的：探討Slit2蛋白表達水平與早期宮頸鱗癌患者的臨床病理特征及預后的關系。方法：選擇2005年1月-2010年12月在中山大學附屬第一醫院經手術治療的早期宮頸鱗癌患者共115例，正常宮頸上皮20例及高級別宮頸鱗狀上皮內病變30例，采用免疫組化方法檢測組織中Slit2的表達情況，分析其表達與宮頸癌預后的關系。結果：Slit2蛋白在正常宮頸、高級別宮頸鱗狀上皮內病變宮頸組織及早期宮頸鱗癌組織中的陽性表達率呈逐漸下降趨勢（P<0.001）。在早期宮頸鱗癌組織中，Slit2蛋白的表達與FIGO分期、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴脈管浸潤及淋巴結轉移均顯著有關（P<0.05），而與年齡、組織分化程度無關（P>0.05）。Slit2陰性表達患者術后5年總生存率顯著低于陽性表達患者，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：Slit2的表達可能參與了宮頸癌的發生，與腫瘤臨床病理特征和預后明顯相關。

【關鍵詞】 Slit2 宮頸鱗癌 免疫組化 臨床病理特征 5年總生存率

Expression and Significance of Slit2 Protein in Early Cervical Squamous Cell Carcinoma/ZHU Weiyan， LIU Tianyu， LIU Yongzhu， ZHANG Xinning， YAO Shuzhong. //Medical Innovation of China， 2020， 17（01）： -135

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between the expression level of Slit2 protein and the clinicopathological features and prognosis of patients with early cervical squamous cell carcinoma. Method：From January 2005 to December 2010， 115 cases of early cervical squamous cell carcinoma， 20 cases of normal cervical epithelium and 30 cases of high-grade cervical squamous intraepithelial lesions were selected from the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. The expression of Slit2 was detected by immunohistochemistry， the relationship between its expression and the prognosis of cervical cancer was analyzed. Result： Slit2 protein in normal cervix， expression of high-grade cervical squamous intraepithelial lesions and cervical cancer， cervix tissue was gradually decreased （P<0.001）. In early cervical squamous cell carcinoma， the expression of Slit2 protein was significantly correlated with FIGO stage， tumor size， depth of invasion， lymphatic vessel infiltration and lymph node metastasis （P<0.05）， but not related to age and tissue differentiation （P>0.05）. The 5-year overall survival rate of patients with negative expression of Slit2 was significantly lower than that of positive patients （P<0.05）. Conclusion： The expression of Slit2 may be involved in the occurrence of cervical cancer， which is significantly associated with the clinicopathological features and prognosis of the tumor.

[Key words] Slit2 Cervical squamous cell carcinoma Immunohistochemistry Clinicopathological features 5-year overall survival

First-authors address： The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University （Qingyuan Peoples Hospital）， Qingyuan 511518， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.01.034

宮頸癌是婦科最常見惡性腫瘤之一，目前是居于世界第三位的女性惡性腫瘤，已成為威脅女性健康和生命的嚴重疾病[1]。宮頸癌的發生與人乳頭瘤病毒感染相關[2-3]，但一些基因也參與了宮頸癌的發生發展[4]。Slit2是一種分泌性糖蛋白，在鼻咽癌、直腸癌、胃癌等消化道腫瘤及乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等生殖系腫瘤中均有表達[5]。研究表明Slit2在多種惡性腫瘤中表達異常，并參與腫瘤的生長與轉移[6-11]。許多學者發現Slit2在腫瘤中表達下降，發揮抑癌基因的作用[9]。基于此，該研究旨在分析Slit2蛋白表達水平與早期宮頸鱗癌患者的臨床病理特征及臨床預后的關系，以期為子宮頸癌的預防、治療及預后判斷提供新的靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年1月-2010年12月在中山大學附屬第一醫院經手術治療的早期宮頸鱗癌（ECSCC）患者共115例。（1）納入標準：①局限于宮頸部位的宮頸癌，臨床分期在ⅡA2期以內;②術前病理檢查明確鱗狀細胞癌;③標本切取前未接受放療、化療等治療;④心肺等重要臟器功能可以耐受手術;⑤術后堅持接受隨訪。（2）排除標準：①術前曾接受放療、化療;②病理檢查提示非鱗狀細胞癌;③病歷資料不完全，或不能配合隨訪;④腫瘤臨床分期超過ⅡA2期;⑤心肺功能不全，或合并其他嚴重內科疾病不能耐受手術。另選擇同期子宮肌瘤行全子宮切除術獲得正常宮頸上皮（NCT）患者共20例，高級別宮頸鱗狀上皮內病變（HSIL）行宮頸錐切術患者共30例。所有患者在患者和家屬知情、自愿參與的情況下開展，病例納入和隨機分組方法均經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法 手術切除三組宮頸組織，制作免疫組化石蠟切片，運用免疫組化方法檢測Slit2蛋白的表達情況。主要步驟：常規制作組織切片，厚度5 μm，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，抗原修復，加入3% H2O2溶液27 ℃孵育20 min，滴加正常山羊血清工作液，27 ℃孵育30 min;滴加鼠抗兔TSG-6單克隆抗體一抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰2000），置于濕盒內4 ℃孵育過夜，以正常小鼠IgG代替一抗作為陰性對照;滴加驢抗鼠IgG多克隆抗體二抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰500），置于濕盒中27 ℃孵育20 min;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（江蘇碧云天科技有限公司），置于濕盒中27 ℃孵育20 min，PBS振蕩洗滌5 min×3次;DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分化、氨水返藍、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、室溫晾干、光學顯微鏡下觀察。

1.3 評價標準 采用雙盲法，以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達，染色強度分4級：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比，即某類細胞5個視野（每400×高倍視野計數100個此類細胞）中陽性細胞所占比例的平均數，也可分為4級：0～5%，為0分;6%～25%，為1分;26%～50%，為2分;51%～75%，為3分;>75%，為4分。將上述兩項指標（染色強度和陽性細胞百分比）分數相乘，按乘積結果評定免疫組化結果，即乘積0～2分為陰性，≥3分為陽性表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件包分析實驗數據，計量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗，均采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組Slit2蛋白的表達情況比較 Slit2蛋白在NCT、HSIL及ECSCC組織中的陽性表達率呈逐漸下降趨勢，差異有統計學意義（P<0.001）。并且NCT、HSIL、ECSCC三組中兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.005）。見表1。

2.2 Slit2蛋白陽性表達與早期宮頸鱗癌臨床病理特征的關系 早期宮頸鱗癌組織中，Slit2蛋白的陽性表達與臨床FIGO分期（P=0.019）、腫瘤大小（P=0.033）、浸潤深度（P=0.003）、淋巴脈管浸潤（P=0.022）及淋巴結轉移（P=0.038）顯著相關，而與年齡、組織分化程度無關（P>0.05）。見表2。

2.3 Slit2蛋白表達與早期宮頸鱗癌臨床預后的關

系 根據免疫組化評分結果，將115例早期宮頸鱗癌分為Slit2高表達組和Slit2低表達組。其中Slit2高表達組32例，Slit2低表達組83例。運用Kaplan-Meire生存分析，Slit2低表達組患者的術后生存率較Slit2高表達組降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

3 討論

宮頸癌的發生發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，其癌變過程的分子基礎包括抑癌基因的表達下降以及癌基因的異常過表達。DNA甲基化是抑癌基因失活的一個主要原因，它主要發生在啟動子區的CpG島。研究發現，宮頸癌中普遍存在抑癌基因啟動子高甲基化的現象[12]。因此，研究抑癌基因甲基化有助于進一步揭示宮頸癌發生發展的機制。美國學者Narayan等運用定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）發現，在浸潤性宮頸癌中Slit2在mRNA水平表達下降、其啟動子甲基化水平升高，提示Slit2表達水平改變參與宮頸癌發生發展的過程[13]。

文獻[14]報道Slit2在血管形成過程中也發揮了重要作用，由于受體的不同，其在腫瘤血管生成中的作用也會發生改變，在腫瘤生長的早期Slit2主要起抑制腫瘤生長作用，而在腫瘤血管形成期，Slit2則通過對血管內皮細胞的趨化作用和促進血管生成的作用從而促進腫瘤的生長和轉移[15]。

Slit2無論是在腫瘤的凋亡、血管新生，還是侵襲轉移方面，均發揮了重要作用，并且前期其他學者的研究已經發現在宮頸癌變過程中Slit2的表達發生改變[16]。本研究中，筆者發現SLIT2蛋白在正常宮頸上皮、高級別宮頸鱗狀上皮內病變及早期宮頸鱗癌組織中陽性表達率呈逐漸下降趨勢。同時Slit2蛋白的表達與宮頸癌臨床FIGO分期、腫瘤大小、宮頸肌層浸潤深度、淋巴脈管浸潤及淋巴結轉移相關，與年齡、組織分化程度無關。本研究與黃小莉等[17]報道Slit2蛋白與宮頸癌臨床分期、宮頸癌浸潤深度、淋巴結轉移有關，與年齡、組織分化無關基本相符，但本研究提示Slit2蛋白表達與腫物大小有關，與黃小莉等[17]報道不一致。而且Slit2陰性表達患者術后5年總生存率較Slit2陽性表達患者明顯降低，與國外報道結果相符[18-20]。此結果提示在早期宮頸癌中Slit2的表達下調可能增強了宮頸癌細胞的增殖能力，可能促進宮頸癌的惡性進展，可作為預測宮頸癌預后的指標之一，有可能成為早期宮頸癌新的診治標志物或者治療靶點。對宮頸癌病理組織結果Slit2蛋白陰性者臨床應高度重視，制定個體化綜合治療方案，嚴密隨訪，適當增加隨訪次數，縮短隨訪間隔，以降低宮頸癌治療后的復發和轉移。

綜上所述，Slit2的表達可能參與了宮頸癌的發生，與腫瘤臨床特征和預后明顯相關;可作為預測宮頸癌生存預后的有效指標之一，有可能成為早期宮頸癌新的治療靶點。

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（收稿日期：2019-06-20） （本文編輯：周亞杰）