MicroRNA-1271通過靶向mTOR抑制腎癌細胞的增殖和遷移

程力維 劉緒 袁曉露 曾吉

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一種常見的致死性惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的5%，是全球十大最常見癌癥之一［1］，全球每年報告約270 000例腎細胞癌新病例和116 000例腎細胞癌相關死亡［2］。RCC 可根據不同的生物學特性和治療方法分為不同的組織學亞型，包括透明細胞癌（KIRC）、乳頭狀腎癌（KIRP）和嫌色細胞癌（KICH）等［3］，其中腎透明細胞癌是最常見的成人腎臟的致命癌癥，占RCC 報告病例的70%～80%，且預后較差［4］。其中如何抑制腫瘤細胞的增殖是RCC 臨床治療面臨的主要挑戰之一［1］。因此，研發抑制RCC 細胞增殖的新藥迫在眉睫。

MicroRNA（miR）被認為是一類進化保守的小非編碼RNA 分子，通常長度為18～25 個核苷酸［5］。MicroRNA 在包括細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學進程中均起著重要的調控作用［6］。因此，microRNA 表達異常與腫瘤的發生和發展密切相關［4］。miR-1271 位于類ADP 核糖基化因子10 基因的一個內含子上，該小RNA 與miR-96 同源，大量的研究證明miR-1271 的表達下降與各種人類癌癥的進展相關，如肝細胞癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌［7-8］等。但是目前尚無有關miR-1271 在腎癌中作用的報導，本研究旨在說明miR-1271 同樣與腎癌的發展密切相關，為腎癌的發展機制提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本收集2018年8月至2019年5月岳陽市一人民醫院病理科11例腎癌患者腫瘤組織及對應的正常組織樣本，其中透明細胞癌10例、乳頭狀腎癌1例，其中男7例，女4例，平均年齡57.4 歲，組織立即在液氮中冷凍并在-80 ℃保存，干冰運輸。以上樣本排除了接受過化療、放療和介入治療的樣本。該項研究得到了本院倫理委員會的批準。

1.1.2 實驗材料HEK-293T 細胞系為本實驗室之前保存，769-P 和786-O 細胞系購于ATCC，RPMI-1640 培養基、DMEM 培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Gibco 公司，TRIzol?、PrimeScriptTMRT Master MIX 逆轉錄試劑盒、TB GREEN?Fast qRTPCR Mix 熒光定量檢測試劑盒、Mir-XTMmiRNA First-strand Synthesis and TB GREENTM qRT-PCR和Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System 檢測試劑盒均購自日本Takara 公司，轉染試劑LipofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司，本實驗所用抗體均購于武漢三鷹生物科技有限公司，miR-1271 mimic、miR-1271 inhibitor 及其對照物均由吉瑪基因（上海）合成，細胞培養瓶、6 孔板、24 孔板、Transwell 小室均購于美國康寧公司，pMIR-Report Luciferase 載體購于Ambion 公司，雙熒光素酶報告系統試劑購于美國Promega 公司，克隆用酶和試劑均購于莊盟生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染786-O 和769-P 細胞培養條件為RPMI-1640 培養基、10%的胎牛血清和1×濃度的青霉素和鏈霉素溶液；HEK-293T 細胞培養條件為DMEM 培養基、10%的胎牛血清和1×濃度的青霉素和鏈霉素溶液，以上細胞均在37 ℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。細胞培養液每兩天更換一次，細胞長滿傳代。收集處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

分別將miR-1271 mimic、miR-1271 inhibitor 及其對照NC mimic/inhibitor 轉染786-O 細胞，并分別命名為miR-1271 mimic 組，miR-1271 inhibitor 組，NC-mimic 組和NC-inhibitor 組。根據需要對細胞進行瞬時轉染處理，具體轉染步驟參照轉染試劑LipopfectmineTM 3000 的使用說明書進行，簡要步驟如下：當培養板中786-O 細胞生長密度達到50%～70%時，使用無血清培養基OPTI-Medium 將microRNA/質粒和轉染試劑分別稀釋至說明書推薦濃度并輕柔混勻。然后將分別稀釋后的轉染試劑與microRNA/質粒再次混合，室溫靜置5 min 后將混合物均勻添加到無血清培養基的細胞中繼續培養，4～6 h 后更換為完全培養基培養。轉染后24～48 h 收集細胞進行后續實驗。

1.2.2 RNA提取和qPCR檢測收集組織或細胞，然后按照TRIzol?試劑說明書方法提取總RNA。取2 μg 的總RNA 用Mir-XTM miRNA First-strand Synthesis and TB GREENTM qRT-PCR試劑盒進行逆轉錄反應得到cDNA，以此cDNA 為模板，應用Mir-XTM miRNAFirst-strand Synthesis and TB GREENTMqRT-PCR 試劑盒進行實時熒光定量PCR 檢測miR-1271 的表達量。另外取2 μg 的總RNA 用Prime-Script TM RT Master MIX 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應得到cDNA，以此cDNA 為模板，應用TB GREEN?Fast qRT-PCR Mix 熒光定量檢測試劑盒進行實時熒光定量PCR 檢測gapdh 和mTOR 的表達量。實時熒光定量PCR 擴增得到循環閾值（Ct 值），采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達數據。實驗以U6 為內參檢測miR-1271 的表達，以gapdh 為內參檢測mTOR 的表達，其中miRNA 檢測的下游引物和U6 引物由試劑盒提供，miR-1271 的上游引物序列為5′-CTTGGCACCTAGCAAGCACTCA-3′，gapdh 上游引物序列為：5′-TCATGAAGTGTGACGTGGACATC-3′；下游序列為：5′-CAGGAGGAGCAATGATCTTGATCT-3′。mTOR 上游引物序列為：5′-AGATTTAATGGAGGCCCAGG-3′；下游序列為：5′-GGCCTCTGTTTGGATGTGAT-3′。PCR 反應體系包括PCR Mix 10 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL 和ddH2O 6 μL。PCR 擴增條件為95 ℃預變性15 s，95 ℃10 s，60 ℃60 s（收集熒光），共40 個循環。溶解曲線程序為95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s，每0.3℃收集一次熒光。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖瞬時轉染786-O 細胞24 h 后，收集各處理組細胞并制成細胞懸液，以5 × 103個細胞/孔接種于96 孔板中，每組設置4 個復孔，同時設置空白對照孔。待細胞分別培養24、48、72 及96 h 后，每孔加入10 μL Premix WST-1，繼續在培養箱中培養4 h 后，檢測450 nm 波長處的吸光度（OD450），并以690 nm 波長處的吸光度值校正，以此反映細胞增殖活性，并繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移能力786-O細胞瞬時轉染24 h 后，胰蛋白酶消化處理的細胞，用無血清的細胞培養基重懸細胞，分別制備成5 × 105/mL的細胞懸浮液，每個transwell小室中加入100 μL的細胞懸浮液，然后在下室中每孔加入500 μL 含10%胎牛血清的培養基，置于細胞培養箱中繼續培養24 h。取出transwell 小室，用棉簽擦掉小室內部未穿過底膜的細胞，用多聚甲醛固定細胞15 min，置于0.1% 結晶紫溶液中染色，隨機選取10 個視野，于顯微鏡下計算穿膜細胞數量，每種處理復孔3 次。

1.2.5 miR-1271靶基因預測分別使用target Scan（http：//www.targetscan.org/）和miRDB（http：//mirdb.org/miRDB/）網站預測miR-1271 可能的目標靶基因，并篩選出兩個網站同時高評分的靶基因進行實驗驗證。

1.2.6 載體構建將mTOR 基因的3′-UTR 構建到pMIR-Report Luciferase 載體上（mTOR-3′-UTR），構建載體所用限制性內切酶為Hind III 和Sac I，構建所用引物序列為：mTOR-F：5′- CCCAAGCTTCTGGAGGCCCAGATGTGC-3′；mTOR-R：5′-AAAGAGCTCACATATGTTTAAAATTCTGATGTCATTT-3′。在此基礎上將miR-1271 與mTOR 結合的靶位點進行突變設計，設計引物序列為：mTOR-mF：5′- GTTGTATCAGAATAATTTTTGAGGCTATAA-3′ ；mTORmR：5′-AATTCTGATGTCATTTATAGCCTCAAA-3′。PCR 擴增的產物通過同源重組的方法連接轉化篩選陽性克?。╩TOR-3′-UTR-mut）。

1.2.7 熒光素酶實驗將HEK-293T 細胞均勻接種于24 孔板中，待細胞生長密度達到50%～60%后，將構建的熒光素酶報告質粒（mTOR-3′-UTR，0.5 μg/孔）和突變質粒（mTOR-3′-UTR-mut，0.5 μg/孔）以及pRL-TK 質粒（0.1 μg/孔）共轉染至HEK-293T細胞中，轉染48 h后，收集細胞，用PBS清洗細胞一次，然后每孔加入100 μL的passive lysis buffer，室溫震蕩30 min，然后4 ℃12 000 g 離心收集裂解后細胞上清，取250 μL 上清加入等體積的LABII，輕柔混勻，測量吸光值，然后再加入250 μL Stop＆Glo，再次混勻后測量吸光值，檢測結束后，根據LABII 和Stop＆Glo 兩次熒光值的比值，分析啟動子的熒光活性。實驗中每個處理重復4 次。

1.2.8 Western blotting 檢測mTOR 蛋白的表達細胞轉染處理48 h 后使用胰酶消化并收集細胞，使用RIPA 裂解細胞并通過BCA 法定量測定蛋白濃度，100 ℃變性蛋白5 min。配制10%SDS-PAGE凝膠，各組取30 μg 總蛋白上樣電泳，電泳完成后將凝膠轉移到PVDF 膜上，并用含5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人GAPDH 抗體或兔抗人mTOR 抗體（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜后，TBST 洗滌膜3 次，然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶3 000），室溫反應2 h，然后再使用TBST 洗滌3 次，加入化學發光劑，在暗室中用X 線膠片曝光，常規顯影、定影。

1.2.9 miR-1271 在腎癌患者中的生存期分析OncoLnc（http：//www.oncolnc.org/）是一個專業解析TCGA 數據庫中mRNA、miRNA 和lncRNA 等基因表達水平與癌癥患者生存期的生物信息學網站。將miR-1271 的標準名稱“HSA-MIR-1271-5P”輸入網站查詢，在接下來的頁面中選擇需要研究的癌癥KIRC 和KIRP，選擇合適的參數，點擊“Submit”得到生存期曲線圖和P值。

1.3 統計學方法利用SPSS 19.0 統計分析軟件對相關數據進行統計學處理，實驗數據采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，計數資料（Transwell 小室實驗）采用χ2檢驗，實驗至少重復3 次。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-1271 在腎癌組織中低表達實時熒光定量PCR 分析miR-1271 在11例腎癌和癌旁組織的表達結果表明，miR-1271 在腎癌組織中表達顯著低于正常組織（t= 9.692，P＜0.05，圖1A）。另外分別分析miR-1271 在HEK-293T、786-O 和769-P中的相對表達情況，結果表明，miR-1271 在HEK-293T 細胞系中的相對表達量顯著高于769-P 和786-O 細胞系中的表達量，差異有統計學意義（t=4.36，P＜0.05；t= 38.938，P＜0.01），其中786-O 中的表達較769-P 更低（t= 4.295，P＜0.05），所以選擇以786-O 深入研究（圖1B）。

2.2 miR-1271 在腎癌中的表達預測和生存期預測分析OncoLnc 網站分析miR-1271 在KIRC 和KIRP 的表達情況，CoxCoefficent 結果均為負數，說明miR-1271 基因的低表達會增加死亡的風險，“P-Value”結果表明上面的結果分析具有統計學意義。結果見表1和圖2所示。

圖1 miR-1271 在腎癌組織和不同腎細胞系中的相對表達Fig.1 The relative expression of miR-1271 in RCC tissues and RCC cells

表1 miR-1271 在腎癌中表達的死亡風險預測Tab.1 Prediction of death risk of expression of miR-1271 in RCC

圖2 miR-1271 在腎癌中的生存期預測分析Fig.2 Predictive analysis of the survival time of miR-1271 in RCC

2.3 miR-1271 影響786-O 細胞的增殖為了探討miR-1271 的表達變化對786-O 細胞增殖的影響，分別將NC-mimic、NC-inhibitor、miR-1271-mimic 和miR-1271 inhibitor 瞬時轉染786-O 細胞。MTT 實驗表明，盡管24 h 時細胞的增殖差異不明顯，但從48 h開始，NC-mimic組OD值為（0.46±0.05），過表達組（miR-1271-mimic）OD值為（0.33±0.06）；而NCinhibitor 組OD值為（0.47±0.07），沉默組（miR-1271-inhibitor）OD值為（0.58±0.05），差異具有統計學意義（P＜0.05），72 h 和96 h 的結論與48 h 類似，且786-O細胞的增殖差異具有統計學意義（P＜0.05），可見，miR-1271-mimic 能明顯延緩786-O 細胞的增殖，而miR-1271 inhibitor 則會促進786-O 細胞的增殖，結果見圖3。

2.4 miR-1271 能抑制786-O 細胞的遷移實驗采用transwell技術分析miR-1271對786-O細胞遷移的影響。穿孔細胞計數表明，與NC-mimic 組（140.3± 12.9）相比，miR-1271-mimic 處理組（76.3 ± 19.1）的786-O 細胞數量明顯減少；與NC-inhibitor 組（142.4 ± 13.5）相比，miR-1271-inhibitor 組（194.3 ±29）786-O 細胞的數量明顯增多，結果表明miR-1271 的表達變化的確影響786-O 細胞的遷移（P＜0.05，圖4）。

圖3 miR-1271 影響786-O 細胞的增殖Fig.3 MiR-1271affects the proliferation of 786-O cells

2.5 miR-1271 通過靶向mTOR 的3′-UTR 調控表達miR-1271 靶向基因預測結果表明，TargetScan和miRDB 網站同時預測出miR-1271 可以靶向FOXQ1、ZEB1、TWIST1、ALK、CCNG1、HOXA5、CDK1 和mTOR 等基因的3′-UTR，且其中大多數的結合已經被實驗證實報道［9］，故本實驗主要研究miR-1271 與mTOR 的相互作用。網站預測的miR-1271 與mTOR 的相互作用位點見圖3A。另外通過下載NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中不同物種的miR-1271（miR-1271-5P）數據比對表明，miR-1271 序列在人、黑猩猩、大猩猩、獼猴、鼠、牛、豬、犬、羊、馬和大棕蝠等哺乳動物中高度保守（圖5A）；進一步分析以上物種與mTOR 的3′-UTR結合位點表明，不同物種的miR-1271 與各自物種的mTOR 基因的3′-UTR 結合序列具有高度的保守性（圖5B）。以上結果提示，mTOR 是一個進化上保守的mircoRNA，不同物種間均可以通過結合mTOR 基因調控生命活動過程。

圖4 miR-1271 對786-O 細胞侵襲能力的影響Fig.4 The effects on 786-O cells invasiveness by miR-1271

分別對HEK-293T 細胞轉染mTOR 野生型和突變型質粒，同時交叉轉染NC-mimic 和miR-1271 mimic 并分析細胞的熒光素酶活性，實驗結果表明，共轉染miR-1271 + mTOR-3′-UTR 的細胞熒光素酶活性較野生型顯著下降（t=5.068，P＜0.05），將結合位點突變后熒光素酶活性改變不顯著（P＞0.05，圖5C、D）。

圖5 miR-1271 靶向mTOR 基因的3′-UTRFig.5 MiR-1271targeted to the 3′-UTR of mTOR

2.6 miR-1271 負調控mTOR 的表達基因和蛋白水平均表明，過表達miR-1271 能降低786-O 細胞mTOR 的表達，而抑制miR-1271 的表達則可以促進mTOR 的表達（P＜0.05，圖6）。

圖6 miR-1271 負調控mTOR 的表達Fig.6 MiR-1271 negatively regulates the expression of mTOR

3 討論

腎癌是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，又稱為腎細胞癌或者腎腺癌。腎癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，且男性發病率高于女性，高發年齡50～70 歲，且我國的腎癌發病率呈逐年上升趨勢。腎癌的病因不是很明確，已經因素包括遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等［10］。

microRNA 在生命活動過程中起著至關重要的作用，包括細胞增殖、分化、信號轉導與致癌等［11］。MicroRNA 通過與目標信使RNA 的3′非翻譯區（3′-UTR）結合而成為調節基因表達的重要轉錄后調節因子，越來越多的證據表明，microRNA的表達變化是影響RCC 增殖的重要因素，其通過靶向下游的抑癌或者促癌基因或者基因通路，進而促進或抑制腫瘤的生長［12］。miR-1271 屬于miR-96 的同源基因，兩者序列相似，但功能完全不同，目前僅有少量的報道miR-1271 與腫瘤相關，miR-1271 存在miR-1271-5P 和miR-1271-3P 兩種形式，目前的研究均集中在miR-1271-5P 的功能上，且均默認miR-1271 即為miR-1271-5P。盡管有報導miR-1271 在頭頸癌中上調表達，但目前大多數的報道顯示miR-1271 在癌癥中下調表達，如LIN 等［13］報導miR-1271 在肝癌中通過結合FOXK2 基因的3′-UTR，進而影響肝細胞癌的增殖和遷移，XIANG等［9］研究表明miR-1271可以通過靶向FOXQ1進而抑制胃癌的侵襲和增殖，LIU 等［14］同樣證實miR-1271 可以通過靶向ZEB1 和TWIST1 抑制胰腺癌的侵襲和增殖，LIU 等［15］認為miR-1271 可以通過作用于CCNG1 進而抑制卵巢癌的生長，LI 等［16］研究表明miR-1271 可以通過靶向CDK1 抑制子宮內膜癌的侵襲和誘導細胞凋亡。本研究與這些報道在腎癌細胞中的研究結果一致，miR-1271 均通過抑制促癌基因的表達，進而抑制癌細胞的增殖和侵襲。筆者推測，盡管miR-1271 在少數癌癥中起著促癌作用，但整體而言miR-1271 是一個抑癌的microRNA，且miR-1271 在抑制癌癥的增殖和遷移中起著重要的作用，其可能成為潛在治療腫瘤疾病的一個很重要因子。

mTOR 是一種進化上保守的蛋白激酶，由于mTOR 通路的異常信號與各種惡性腫瘤有關，mTOR 蛋白被認為是細胞生長的關鍵調節因子，并逐漸成為腫瘤治療的新靶點。mTOR 是細胞自噬的抑制因子，其通過參與PI3K/AKT/mTOR 通路發揮其作用，而mTOR 信號通路解除對腫瘤的調控作用主要是通過抑制凋亡、促進細胞存活、加速細胞周期傳遞、增強血管生成、促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［17］。目前已經有大量有關microRNA 可以與mTOR 相互作用進行調控癌癥進程的報答，如Ren 等人報道上調骨肉瘤細胞中的miR-144 能夠下調mTOR 信號通路的活性，抑制骨肉瘤細胞的增殖，從而提高其對地塞米松誘導的凋亡的敏感性［18］，這與本研究結論類似。與此同時，研究表明mTOR 也可以調控microRNA 的合成，YE 等［19］研究表明，生物體可經由mTOR-Mdm2-Drosha 通路來調節microRNA 的生產以適應環境的改變。

本研究表明，在腎癌中，miR-1271 的表達較癌旁組織低；細胞實驗表明，miR-1271 在腎癌細胞中較正常腎細胞下調表達，這種下調表達可以促進癌細胞的增殖和遷移，而在腎癌細胞中過表達miR-1271 則可顯著抑制腎癌細胞的增殖和遷移；進一步研究表明，miR-1271 可以通過與靶基因mTOR 的3′-UTR 結合，進而抑制mTOR 的mRNA 和蛋白表達，從而起到抑癌作用。有趣的是，通過分析TCGA 數據庫中miR-1271 的表達與腎癌患者的生存期結果表明，miR-1271 的高表達的確會延長腎癌患者的生存期，降低死亡的風險，這結果與本實驗的結論完全一致，說明miR-1271 的異常表達的確參與了腎癌的發展過程。

綜上所述，miR-1271 可抑制人腎癌細胞786-O的增殖和侵襲，其機制在于miR-1271 通過靶向mTOR 基因的3′-UTR 抑制了mTOR 的生成，進而抑制了腫瘤細胞的生長增殖。當然本實驗尚存諸多不足，如腎癌樣本量太少，特別是嫌色腎細胞癌沒有收集到（TCGA 網站也缺乏KICH 的生存期數據，可能與這種腎癌本身發病率低有關），沒有能深入分析比較miR-1271 在不同類型腎癌中的表達情況，還需持續收集樣本跟進分析；同時，mTOR 基因只是眾多靶向miR-1271 中的一種，更多的靶標基因和更多與腎癌相關的發生機制尚待去發掘研究。