一株降解石油烴假單胞菌的鑒定及降解特性

2020-05-08 05:05:46曾繁城高鵬飛

吉林化工學院學報 2020年3期

劉虹，曾繁城，高鵬飛

(1.吉林化工學院資源與環境工程學院，吉林吉林 132022；2.吉林省中實環保工程開發有限公司，吉林長春 130031)

近幾年，石油在儲運和加工過程中對水環境、土壤環境等造成的污染日漸嚴重.石油烴一旦進入環境，將在環境介質中不斷地富集，從而對人類的健康及動植物的生長造成嚴重的影響[1-2].石油烴是由不同的碳氫化合物組成的混合物質，主要組分有飽和烴和芳烴等.其組分中，大部分烴類可直接被微生物降解[3-4].因而，在眾多的修復、治理石油烴污染技術中，微生物修復技術被廣泛研究和應用.微生物修復技術是指微生物通過自身的代謝活動，使得環境中殘留的有毒有害物質轉化為無毒無害物質或使其含量減少[5].微生物法具有高效、降解徹底、環保等諸多優點，可以將石油烴降解，轉化為無毒的化合物[6-7].

微生物修復石油污染的關鍵因素則是尋找高效的石油降解菌株.在自然環境中，具有降解石油烴能力的微生物種類繁多、分布廣泛.已報道的研究中，被應用的石油烴微生物降解菌已經多達100多屬200多種[8].其中，石油烴類降解的微生物中細菌的降解效果最為顯著，在已報道的降解石油烴細菌中假單胞菌屬(pseudomonas)是常見的一種.另外，還有銅綠假單胞菌屬、交替假單胞菌屬等對石油烴降解的相關研究報道[9-11].本文從松原油田石油污染土壤中篩選、分離出一株以石油烴為唯一碳源的降解菌株，對其菌落進行了觀察，通過16S rDNA 序列分析對其進行鑒定為類產堿假單胞菌，并研究其降解石油烴特性，旨在豐富石油烴的降解菌種，揭示菌株降解石油烴的潛力，為實際石油烴污染場地的修復提供理論依據及降解菌源.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

無機鹽液體培養基：

(NH4)2SO42 g，K2HPO41.55 g，NaH2PO40.85 g，MgCl2·6H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，CaCl2·2H2O 0.001 g，1 mL微量元素儲備液，補足蒸餾水至1 000 mL.

LB液體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.4～7.6.

固體培養基：在LB液體培養基中加入1.5%的瓊脂.

石油烴培養基：于上述無機鹽培養基中加入0#柴油.

主要儀器設備：LD4-2A 醫用離心機、氣相色譜儀(Agilent7890B)、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、SP-DJ垂直凈化工作臺、HZQ-QX 全溫振蕩器、PTC-200 型 PCR 儀(美國)等.

1.2 實驗過程

1.2.1 總石油烴測試方法

1.2.2 菌落形態觀察

于錐形瓶中制備100 mL LB液體培養基，向培養基中接入菌株，置于130 r/min、30 ℃下振蕩器培養24 h，從而制備菌懸液，并將菌懸液稀釋至10-8個/L，取50 ul菌液涂布于LB固體平板培養基上，置于30 ℃生化培養箱中培養48 h，觀察、記錄菌落形態.

1.2.3 菌株的16S rDNA鑒定

所用細菌通用引物：上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3(委托上海生工生物工程技術有限公司完成引物合成和PCR產物的測序).

PCR擴增程序：96 ℃預變性1 min，96 ℃變性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，總計25個循環；最后于4 ℃冷藏保存.然后取5 μL 反應液與1 μL 6×上樣緩沖液進行混合，PCR反應的產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.4 菌株降解石油烴特性

(1)溫度對菌株降解石油烴效果影響的研究

配置100 mL無機鹽液體培養基，加入0#柴油，使其濃度為2 000 mg/L，然后接入5 mL菌懸液，同時輔以加入0#柴油、不加菌的無機鹽液體培養基作為空白對照，實驗設置2個平行樣品.置于130 r/min，溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃的振蕩器中培養.6 d后，每個樣品分別取50 mL，各加入10 mL正己烷進行液液萃取.萃取后的有機相采用無水硫酸鈉進行脫水，最后經GC檢測樣品中總石油烴的殘留量，從而計算菌株對石油烴的降解率.

(2) pH值對菌株降解石油烴效果影響的研究

調節含有2 000 mg/L 0#柴油的無機鹽液體培養基pH值分別為5、6、7、8、9，分別加入5 mL制備好的菌懸液，同時輔以加入0#柴油、不加菌的的無機鹽液體培養基作為空白對照，實驗設置2個平行樣品.然后將樣品置于130 r/min、35 ℃的振蕩器中培養.6 d后，每個樣品分別取50 mL，各加入10 mL正己烷進行萃取.萃取后的有機相采用無水硫酸鈉進行脫水，最后經GC檢測樣品中總石油烴的殘留量，從而計算菌株對石油烴的降解率.

2 結果與討論

2.1 菌落形態觀察

由圖1看出，該菌落呈白色不規則狀、表面粗糙、邊緣不整齊.

圖1 菌落形態圖

2.2 菌株的16S rDNA鑒定

2.2.1 菌株PCR擴增

菌株的PCR擴增結果如圖2所示

圖2 菌株的16S rDNA PCR 擴增產物電泳圖

由圖2可以看出，菌株16S rDNA PCR擴增產物為一個1 500 bp左右的片段，測序結果表明其16S rDNA 序列全長為1 476 bp，這說明是其擴增產物，符合測序要求.

2.2.2 16S rDNA序列分析以及系統發育樹的構建

將所得TM菌株的序列信息輸入到Gen Bank數據庫進行BLAST分析，選擇同源性大于98%的基因序列，用Bioedit和MEGA5.0軟件對系統發育進行分析，之后用Neighbor-joining構建系統發育樹，500次重復檢測，計算自引導值(Bootstrap)以估計系統進化樹的置信度.結果如圖3所示.

圖3 菌株基于16S rDNA的系統發育分析

由圖3可知，與該菌株同源性最高的可培養菌株為Pseudomonas pseudoalcaligenes strain，因此，推斷該菌株為類產堿假單胞菌.在已有的關于污染物微生物降解的研究中，僅有關于該菌株降解硝基苯動力學的報道[12]，而關于該菌株在石油烴微生物降解方面未見報道.

2.3 溫度對菌株降解性能影響

溫度對類產堿假單胞菌株降解特性影響結果如圖4所示.

培養溫度/℃圖4 不同溫度下類產堿假單胞菌降解石油烴效果

溫度的降低或升高會影響到菌株細胞膜的流動性及相結構，影響微生物細胞內的酶活性，也會影響支鏈脂肪酸和環狀脂肪酸的比例等，從而影響菌株的生長率[13].除了嗜熱菌株和嗜冷菌株外，大多數菌株在外界環境溫度為20～40 ℃時生長最適宜.考察菌株生長溫度，選擇菌株最佳的生長溫度，有助于維持細胞內的酶活性，提高微生物降解有機物的速率，從而促進微生物對石油烴的降解.由圖4可知，該菌株在35 ℃時，對石油烴的降解效果最好，降解率達到75.4%.當溫度逐漸升高或者降低時，菌株對石油烴的降解率也隨之降低.