Meprinα 對TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞膠原合成的調(diào)節(jié)作用

王 珺，張 乙，張?jiān)妳R，靳馥宇，李 田，徐 洪

（華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/河北省器官纖維化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063210）

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰-絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰 -脯氨酸（n-acetyl-serylaspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）能夠顯著拮抗矽肺大鼠肺纖維化，在體外能夠抑制轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1介導(dǎo)膠原合成和肌成纖維細(xì)胞分化[1-2]。Ac-SDKP來源于胸腺素β4，其中內(nèi)肽酶meprinα 是胸腺素β4水解成為Ac-SDKP的關(guān)鍵酶之一[3-4]。Meprin屬于金屬蛋白酶超家族，含有α 和β兩個(gè)亞基，能夠水解基質(zhì)膜蛋白、細(xì)胞因子、緊密連接蛋白、生長因子、蛋白激酶等多種成分，一些研究認(rèn)為Meprin在器官纖維化中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[5-6]。因此本研究擬通過體外原代培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞，并予以TGF-β1誘導(dǎo)向肌成纖維細(xì)胞分化，觀察重組Meprinα 對肺成纖維細(xì)胞膠原合成和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）（10099141，美國GIBCO公司）；胎牛血清（BI-SH0019，以色列BI公司）；GAPDH兔多克隆抗體（sc-25778，美國Santa Cruz公司）；I型膠原（ab34710，英國Abcam公司）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab32575）、M eprin α（ab232892）；重組 TGF-β1蛋白（240-B，美國R&D公司）、重組Meprin α 蛋白（4007-ZN，美國R&D公司）、放線酰胺素（Actinonin，c3331，美國APExBIO公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

采用貼壁法培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞，取新生1～3 d乳鼠，取肺組織剪成小塊兒，采用血清平鋪于培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)放置6 h。待細(xì)胞爬出呈次融合狀態(tài)時(shí)，傳代，取3～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同步化24 h后，細(xì)胞分組為：（1）對照組：無血清培養(yǎng)；（2）TGF-β1誘導(dǎo)組：無血清培養(yǎng)條件下，予以5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)；（3）Meprin α 預(yù)處理組：無血清培養(yǎng)條件下，先予以100μmol/L Meprin α預(yù)處理1 h，再給予5 ng/mL TGF-β1共誘導(dǎo)；（4）Actinonin預(yù)處理組：無血清培養(yǎng)條件下，先予以20μmol/L actinonin預(yù)處理1 h，再給予5 ng/mL TGF-β1共誘導(dǎo)。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

按照5×103/ 孔將細(xì)胞種植于96孔板，同步化后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并誘導(dǎo)，24 h后每孔加入10μL CCK溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀于450 nm測定吸光度。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

以2×105/孔的密度將細(xì)胞種植于24孔板，同步化后使用200μL槍頭劃痕，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并誘導(dǎo)，分別于0 h、48 h倒置顯微鏡下拍照，采用IPP 6.0圖像分析軟件測定劃痕區(qū)域面積，遷移率計(jì)算公式

1.5 免疫細(xì)胞熒光染色

細(xì)胞常規(guī)爬片，高壓修復(fù)，血清封閉1 h，滴加α-SMA一抗（1:200）4℃過夜，次日二抗37℃孵育1 h，含DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察掃圖。

1.6 免疫印跡

每25 cm2培養(yǎng)瓶加入100μL細(xì)胞裂解液，冰上靜置15 min，刮取細(xì)胞移至EP管，12 000 g離心15 min取上清。Brafford法測定蛋白濃度，10μg/ 泳道上樣，常規(guī)電泳和電轉(zhuǎn)。孵育Meprin α、α-SMA、I型膠原一抗（1:1 000）4 ℃過夜，二抗（1:5 000）37℃1h后，ECL發(fā)光顯色，采用Image-Lab 5.1軟件定量分析條帶，目的條帶的OD值經(jīng)相應(yīng)內(nèi)參平衡后與對照組的比值作為該蛋白的相應(yīng)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 重組Merpin α 能夠抑制TGF-β1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖

與對照組相比較，TGF-β1誘導(dǎo)組的OD值增加；與TGF-β1誘導(dǎo)組相比較，Merpin α 預(yù)處理組的OD值減小，經(jīng)方差分析差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Actinonin預(yù)處理組OD值與TGF-β1誘導(dǎo)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 重組Merpin α 能夠抑制TGF-β1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的遷移

與對照組的相比較，TGF-β1誘導(dǎo)組的遷移率增高；與TGF-β1誘導(dǎo)組相比較，Merpin α 預(yù)處理組的遷移率降低，Actinonin預(yù)處理組遷移率升高，經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.3 重組Merpin α 能夠抑制TGF-β1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的I型膠原和α-SMA的表達(dá)

見圖2、圖3、表2所示，與對照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組I型膠原、α-SMA表達(dá)水平顯著上調(diào)，Merpin α 表達(dá)水平顯著下調(diào)，免疫熒光染色顯示α-SMA陽性表達(dá)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、表3。與TGF-β1誘導(dǎo)組相比較，Merpin α 預(yù)處理組的I型膠原、α-SMA表達(dá)水平顯著下調(diào)；如圖4、表4所示，與TGF-β1誘導(dǎo)組相比較，Actinonin預(yù)處理組I型膠原、α-SMA表達(dá)水平顯著上調(diào)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 重組Meprin α 和Actinonin對TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響（）Tab.1 The effects of meprin α and actinonin on cell proliferation and cell migration in lung fibroblasts induced by TGF-β1（）

表1 重組Meprin α 和Actinonin對TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響（）Tab.1 The effects of meprin α and actinonin on cell proliferation and cell migration in lung fibroblasts induced by TGF-β1（）

與對照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，#P ＜0.05。

表2 TGF-β1對Meprin α 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用（）Tab.2 The effect of TGF-β1 on the expression of meprin α（）

表2 TGF-β1對Meprin α 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用（）Tab.2 The effect of TGF-β1 on the expression of meprin α（）

表3 重組Merpin α 對TGF-β1介導(dǎo)的COL I和α-SMA的調(diào)節(jié)作用（）Tab.3 The regulation of recombinant meprin α on the ex pression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表3 重組Merpin α 對TGF-β1介導(dǎo)的COL I和α-SMA的調(diào)節(jié)作用（）Tab.3 The regulation of recombinant meprin α on the ex pression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表4 Actinonin對TGF-β1介導(dǎo)的COL I和α-SMA的調(diào)節(jié)作用（）Tab.4 The regulation of actinonin on the expression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表4 Actinonin對TGF-β1介導(dǎo)的COL I和α-SMA的調(diào)節(jié)作用（）Tab.4 The regulation of actinonin on the expression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

3 討論

圖1 重組Merpin α 抑制TGF-β1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的遷移Fig.1 Merpin α inhibits fibroblasts migration induced by TGF-β1

圖2 重組Merpin α 對TGF-β1介導(dǎo)的α-SMA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.2 The effect of merpin α on the expression of α-SMA in lung fibroblast induced by TGF-β1

圖3 TGF-β1對Merpin α 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.3 The effect of TGF-β1on the expression of merpin α in lung fibroblast induced by TGFβ1

圖4 重組Merpin α 和Actinonin對TGF-β1介導(dǎo)的COL I和α-SMA的調(diào)節(jié)作用Fig.4 The effect of merpin α and actinonin on the expression of COL I and α-SMA in lung fibroblasts induced by TGF-β1

Meprins屬于金屬蛋白酶家族，包含兩個(gè)α、β亞基，可以各自或與對方聚合形成寡聚蛋白，其中包含α 亞基的稱為Meprin A蛋白，多定位于膜上或形成可溶性Meprin α 蛋白而分泌到細(xì)胞外基質(zhì)[5-6]。研究表明，Meprin α 在腎小管上皮細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，能夠水解胸腺素β4形成Ac-SDKP，是體內(nèi)Ac-SDKP合成的主要來源之一[3-5]。課題組多年圍繞Ac-SDKP的抗矽肺纖維化作用進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP及其相關(guān)血管緊張素系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽能夠抑制肌成纖維細(xì)胞分化，包括肺泡II型上皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而發(fā)揮拮抗矽肺大鼠肺纖維化的作用[1，2，7-9]，因此推測，Meprin α 可能在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)膠原代謝的作用。

研究表明，Meprinα、β亞基能夠水解I型膠原前肽，誘導(dǎo)原纖維組裝，促進(jìn)膠原成熟；Mep1a-/-和Meplb-/-基因敲除小鼠較野生型小鼠相比較，皮膚膠原纖維排列不規(guī)則，厚度降低，提示Merpins能夠調(diào)節(jié)皮膚膠原代謝[10]。與野生型小鼠相比較，Mep1a-/-、Meplb-/-和雙基因敲除小鼠博來霉素染毒后肺功能、炎癥指標(biāo)差異并不顯著，但Meplb-/-基因敲除小鼠較野生型小鼠其膠原沉積水平降低，提示Meprinβ可能與肺纖維化的形成關(guān)系較為緊密[11]。在針對肺動(dòng)脈高壓的研究中也發(fā)現(xiàn)，Meprin α 能夠抑制炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用[12]。而在腫瘤微環(huán)境的研究中，關(guān)于Meprin α 的作用機(jī)制尚不明確，甚至有爭論。這些研究多認(rèn)為，Meprin α 可水解炎性介質(zhì)、膠原蛋白和生長因子，可以執(zhí)行激活或失活各類活性物質(zhì)的作用[13-15]，但其在纖維化疾病中的具體作用機(jī)制，尚未完全了解。

在本研究中，給予重組Merpin α 預(yù)處理，能夠顯著抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制其向肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積，提示Merpin α 具有抗纖維化作用的潛能。課題組最近的研究也顯示，Merpin α 可被血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2、血管緊張素（1-7）信號(hào)所激活，從而促進(jìn)Ac-SDKP的生成，減輕矽肺纖維化病變程度，抑制肌成纖維細(xì)胞分化[9]。上述結(jié)果說明，外源性給予重組merpin α 能夠調(diào)節(jié)膠原代謝。由于merpin α 的器官定位、細(xì)胞定位以及形成寡聚蛋白成分不同，其作用機(jī)制可能不同，仍需進(jìn)一步研究確定。