細胞色素P450 2E1在甘草甜素治療非酒精性脂肪肝病中的作用

王 礴，夏咸松，李進濤，段小花

（1）云南中醫藥大學教務處；2）昆明醫科大學實驗動物學部；3）云南中醫藥大學民族醫藥學院，云南昆明 650500）

全球流行病學調查研究結果顯示非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發病率逐年升高，已經成為全世界范圍內最常見的肝病，其在正常人群中發病率約為20%～50%，在肥胖人群或高血脂人群中高達90%，其發生率遠超病毒性肝炎或酒精性肝病[1]，在所有發生率中，以西方發過國家最高，其患病率高達28%到45%之間，而在包括我國在內的發展中國家發生率約為10%～25%之間[2]。在上述NAFLD患者中，約有15%的患者可進一步發展為非酒精性脂肪性肝炎，3%的患者可發展為肝硬化甚至肝癌[3]，因此研究和關注NAFLD勢在必行。甘草甜素是中藥甘草的主要藥理活性成分之一，其具有明顯的抗氧化和消炎作用，此外其在保肝方面有較多文獻報道[4-5]，但是關于其治療NAFLD動物研究還沒有文獻報道。為此本研究采用高脂飲食構建NAFLD大鼠模型，采用甘草甜素治療，觀察治療后大鼠肝功能、血脂以及抗氧化指標的變化特點，旨在探討甘草甜素對NAFLD的治療作用，并從細胞素色P450 2E1（cytochromeP450 2E1，CYP2E1）蛋白分析其治療的潛在作用機制，以為中藥甘草的開發和NAFLD的治療提供基礎理論數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 大鼠購于昆明醫科大學動物實驗中心，（許可證號：SYXK[云]2015-0004），大鼠品級為SPF級，5～6周齡、雄性，70只，體重位于180～200 g之間。購買后飼養于云南中醫藥大學科研中心動物實驗部。由專業人員統一飼養于管理，光照/黑暗=12 h/12 h。

1.1.2 主要試劑（1）甘草甜素（98%，食用級）購自南京源植生物科技有限公司；（2）多烯磷脂酰膽堿購于賽諾菲（北京）制藥有限公司；（3）谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；（4）丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽酶（glutathionease，GSH）測定試劑盒購于武漢華美生物科技有限公司；（5）PVDF膜購于美國Millipore公司；（6）GAPDH抗體和細胞素色P450 2E1（cytochromeP450 2E1，CYP2E1）購于美國Santa公司；（7）引物購于武漢塞維爾生物科技公司。

1.2 動物模型構建及樣本采集

1.2.1 NAFLD大鼠模型建立 本研究所有動物實驗均經云南中醫藥大學倫理委員會批準，在購買后先給予適應性喂養1周，后按照隨機數字法分組，將大鼠分為正常組以及實驗組，其中正常組12只，模型組58只，正常組給予普通飼料喂養，模型組則給予高脂飼料喂養，喂養8周后，正常組隨機選取2只、模型組隨機選取8只，處死收集肝臟觀察肝臟病理學結果判斷造模是否成功，造模成功的標準為組織病理學上有1/3以上肝細胞脂變。

模型構建成功后再次后按照隨機數字法將實驗組大鼠分組，分為5個實驗組，分為為模型組、多烯磷脂酰膽堿組、甘草甜素低、中和高劑量組，每組10只，分組后立即給予相應治療，治療時，正常組和模型組每日給予0.9%生理鹽水灌胃，多烯磷脂酰膽堿組每日給予多烯磷脂酰膽堿23 mg/kg灌胃，甘草甜素低、中和高劑量組則每日給予甘草甜素2 mg/kg、4 mg/kg和8 mg/kg灌胃，灌胃時間固定為每日早上9點至10點，共治療6周。

整個實驗期中，正常組大鼠飲食正常，毛色發亮整潔，活動和精神狀態均良好，相較于正常組，模型組精神和活動量在造模第6周就開始明顯減少，但體重增加明顯，毛色相對發黃，糞便發臭。幾個治療組相較于模型組精神狀態有一定改善，毛色和糞便發臭情況明顯改善。此外在整個實驗期中，實驗期間各組大鼠均無死亡。

1.2.2 樣本收集方法 6周后，將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后固定于解剖版，腹主動脈取血法收集血液樣本4℃條件下3 000 r/min，離心10 min，以分離血清，血清收集后儲存于超低溫冰箱中。后取出肝臟，切取肝小葉0.5 cm左右置入4%的組織固定液中保存用于組織病理學檢測，其余組織置入超低溫冰箱中保存備用。

1.3 觀察與檢測指標

1.3.1 一般指標觀察 在整個實驗期中每天均監測各組大鼠的攝食量、飲水量變化，同時每周稱重一次大鼠，觀察大鼠精神以及行為狀態。

1.3.2 血清生化指標檢測 血清生化指標的檢測按照試劑盒提供的說明書進行。

1.3.3 HE染色觀察肝組織病理學 從組織固定液中取出肝臟組織，自來水反復沖洗后采用乙醇逐級脫水、二甲苯透明、浸蠟后石蠟包埋，切片即可，切成3～5μm左右的薄片后采用常規方法[6]對組織進行HE染色即可，完成后采用光學顯微鏡收圖像，每張圖片選取4個不同的視野。

1.3.4 WesternBlot檢測肝臟CYP2E1蛋白表達稱取1 g肝臟組織，用組織裂解液裂解后，采用總蛋白提取試劑盒收集總蛋白，總蛋白收集后定量調平，每組各取50μg行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SD-PAGE），電泳完成后將目的蛋白轉移到PVDF膜，后采用1抗（CYP2E1為1:3 000；GAPDH為1:5 000）封閉過夜，二抗（1:5 000）孵育后，最后采用電化學發光用凝膠成像分析系統各個條帶的光密度值即可，結果以CYP2E1/GAPDH的光密度值比較。

1.3.5 實時熒光定量檢測肝臟中CYP2E1mRNA表達 稱取20μg肝臟組織，用總RNA提取試劑盒提取總RNA后，使用熒光定量PCR儀上將其逆轉錄為cDNA，逆轉錄完成后每組各取1μg行PCR循環，條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，63 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，最終反應完成后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存即可。每份樣品做3次重復，結果采用2-△△Ct法比較分析，引物由武漢塞維爾生物設計并合成，具體為CYP2E1上游：TGCGGAGGTTTTCCCTAAGTA，下游：TGTGCCTCTCTTTGG-ATGCG，產物長度為為82；GAPDH上游：AGGTCGGTGTGAACGGATTT G,下游 ：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA，產物長度為123。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠肝臟病理學

大鼠肝臟病理學HE檢測結果，正常對照組肝臟組織結構完整，可清晰看到分布均勻的細胞核結構，相較于正常組，模型組出現明顯的肝小葉結構破壞，同時肝細胞核腫脹，脂肪空泡浸潤等，與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿組和甘草甜素組均有明細的改善，見圖1。

圖1 大鼠肝臟病理學HE檢測結果（×400）Fig.1 HE staining results of rat liver pathology（×400）

2.2 對大鼠肝功能指標AST和ALT的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中肝功能指標ALT和AST含量明顯增加，且差異具有統計學意義（P＜0.05），經甘草甜素干預后，ALT和AST均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 甘草甜素治療后各組大鼠肝功能比較［n=10，（）］Tab.1 The comparison of liver function in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

表1 甘草甜素治療后各組大鼠肝功能比較［n=10，（）］Tab.1 The comparison of liver function in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。

2.3 對大鼠血脂的影響

與正常組相比，模型組大鼠血脂指標TG，TC，LDL-C和HDL-C均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿和甘草甜素治療后上述四個指標均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 甘草甜素治療后各組大鼠血脂的影響［n=10，（）］Tab.2 The comparison of bloodlipid in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

表2 甘草甜素治療后各組大鼠血脂的影響［n=10，（）］Tab.2 The comparison of bloodlipid in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。

2.4 對大鼠肝臟抗氧化指標的影響

與正常組相比，模型組肝臟組織中SOD和GSH明顯降低，MDA明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿和甘草甜素治療后，SOD和GSH明顯升高（P＜0.05），MDA明顯降低（P＜0.05），見表3。

表3 甘草甜素治療后各組大鼠肝臟抗氧化指標比較［n=10，（）］Tab.3 The comparison of antioxidant index in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

表3 甘草甜素治療后各組大鼠肝臟抗氧化指標比較［n=10，（）］Tab.3 The comparison of antioxidant index in different groups after Glycyrrhizin treatment ［n=10，（）］

與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。

2.5 對大鼠肝臟中CYP2E1蛋白及mRNA表達的影響

與正常組相比，模型組肝臟組織中CYP2E1蛋白及mRNA表達明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿組和甘草甜素組上述指標均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖2、表4。

圖2 大鼠肝臟組織中CYP2E1蛋白表達特點Fig.2 TheCYP2E1proteinsexpression of liver after Glycyrrhizin treatment

表4 甘草甜素治療后各組大鼠肝臟組織中CYP2E1蛋白及mRNA表達的影響［n=10，（）］Tab.4 The CYP2E1 proteins and mRNA of liver in different groups after Glycyrrhizin treatment［n=10，（）］

表4 甘草甜素治療后各組大鼠肝臟組織中CYP2E1蛋白及mRNA表達的影響［n=10，（）］Tab.4 The CYP2E1 proteins and mRNA of liver in different groups after Glycyrrhizin treatment［n=10，（）］

與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。

3 討論

NAFLD發病機制較為復雜，目前國內外廣泛接受的為“二次打擊學說”，“二次打擊學說”涉及內容較多，主要有胰島素抵抗、氧化應激、炎癥刺激、脂質過氧化、脂代謝酶分泌異常等[7]。為獲得和“二次打擊學說”特征相似的動物模型，本研究采用高脂飲食構建NAFLD模型，本模型不僅造模成本相較于基因剔除或過表達的動物模型便宜，其構建的模型也與“二次打擊”有一定相似性，可表現出明顯氧化應激和肝臟脂肪變性[8]。從結果中可以明顯看出，相較于正常組，模型組大鼠出現明顯肝臟病理學改變，同時肝功能和血脂有明顯異常，這提示本研究所構建的模型是成功的。

模型構建成功后筆者采用甘草甜素治療，甘草甜素是目前臨床中常用的護肝藥物[9]。其是中藥甘草的主要活性成分之一，早在傷寒論中就對甘草進行過詳細的描述，其主要功能可歸納為養心復脈、健脾利水、扶正泄痞、利咽清熱、補中溫陽、協調陰陽、柔肝調脾、通達表理、緩急和胃、益氣健中、瀉火解毒、祛痰止咳等[10]。而甘草甜素近年來也有大量文獻報道，多數研究認為甘草甜素具有明顯的抗病毒、抗炎、抗變態反應以及提高免疫能力等[11-12]。本研究采用甘草甜素治療NAFLD大鼠后，研究結果發現，甘草甜素可以明顯的降低肝功能指標AST和ALT，同時降低了血脂指標TG和TC，這提示甘草甜素對NAFLD有明顯的治療作用。

在NAFLD的發生和發展過程中，CYP2E1作為氧化應激的關鍵核心酶蛋白類，其主要負責氧化脂肪酸以及一些有害環境污染物等多種小分子底物作[13]。已有的研究已經證明CYP2E1與NAFLD密切相關，在多數NAFLD患者中，CYP2E1均呈明顯過表達特點[14]，其參與氧化應激主要是通過2個方面實現的：一方面，CYP2E1可直接參與氧化應激，NAFLD發SOD和GSH等多種抗氧化的活性，同時導致機體產生較多的MDA，最終造成脂質過氧化以及炎癥的發生[15]；另一方面CYP2E1是細胞脂質ω 氧化的關鍵核心抑制酶蛋白，CYP2E1過表達可直接造成脂質ω 氧化受阻，最終引起脂質在肝臟中蓄積[16]。本研究結果發現，與模型組相比，經甘草甜素治療后，大鼠肝臟CYP2E1蛋白和mRNA表達均明顯降低，這提示甘草甜素對肝臟CYP2E1表達有直接調控作用，同時研究結果也發現，相較于模型組，甘草甜素治療后，肝臟組織中SOD和GSH明顯升高，MDA明顯降低，這提示甘草甜素對調節抗氧化能力也有一定的作用，結合CYP2E1表達，本研究認為甘草甜素對NAFLD氧化能力的提高可能是通過降低肝臟中CYP2E1的表達實現的。

綜上所述，本次研究結果提示，甘草甜素對NAFLD大鼠肝功能和脂質代謝具有明顯的調節作用，其作用機理可能與甘草甜素可以降低CYP2E1表達，進而提高機體的抗氧化能力有關。