植物DNA甲基化研究進展

高弘揚 許丹蕓 周良云 羅碧 楊全

摘 要：植物經常暴露在各種生物和非生物的脅迫之下，這些脅迫會影響植物的生長發育和繁殖并最終導致植物死亡。為了抵御不利的環境條件，植物已經進化出復雜而精細的網絡來感知脅迫并激活防御系統。為此，植物激活許多信號轉導通路，這些信號轉導通路可以改變一些脅迫響應基因的表達，從而引起植物形態、生理和生化的改變以適應逆境。DNA胞嘧啶甲基化是高等真核生物的主要表觀遺傳機制之一，在維持基因組穩定性和調節基因表達方面起著關鍵作用。表觀遺傳變異比遺傳變異更為靈活。一旦環境條件發生變化，為了適應新的環境植物都會發生表觀遺傳的改變。許多研究表明DNA甲基化參與植物的發育和應激反應。基于相關研究對DNA甲基化進行了綜述，對植物逆境脅迫有重要意義。

關鍵詞：植物;逆境脅迫;DNA甲基化

中圖分類號：Q943 ??文獻標識碼：A ??文章編號：1004-3020（2020）01-0039-06

Abstract：Plants are often exposed to a variety of biological and abiotic stresses that affect plant growth and reproduction and ultimately lead to plant death.In order to resist adverse environmental conditions，plants have evolved complex and elaborate networks to sense stress and activate defense systems.For this reason，plants activate many signal transduction pathways，which can change the expression of some stress response genes，thus causing changes in plant morphology，physiology and biochemistry to adapt to adversity.DNA cytosine methylation is one of the main epigenetic mechanisms in higher eukaryotes，which plays a key role in maintaining genomic stability and regulating gene expression.Epigenetic variation is more flexible than genetic variation.Once environmental conditions change，epigenetic changes will occur in plants to adapt to the new environment.Many studies have shown that DNA methylation is involved in plant development and stress response.DNA methylation is reviewed based on related research，which is of great significance to plant stress.

Key words：plants;stress;DNA methylation

近年來，表觀遺傳修飾，尤其DNA甲基化，對植物適應環境脅迫的作用日益明顯[1]。DNA甲基化（DNA methylation）是真核生物基因組中最早發現的表觀遺傳修飾途徑之一，相關研究已表明，DNA的甲基化能引起真核生物的染色質結構、DNA構象、DNA穩定性以及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而對真核生物的基因表達過程進行調控。在DNA序列中可以發生甲基化的位點有腺嘌呤的N-6位、鳥嘌呤的N-7位和胞嘧啶的N-4位以及胞嘧啶的C-5位，其中胞嘧啶的C-5位修飾是最常見的一種甲基化方式，也是目前DNA甲基化研究的重點和熱點。胞嘧啶C-5位甲基化是由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基團，在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，將胞嘧啶（C）甲基化為5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一種化學反應。大量的研究已經表明，DNA甲基化與植物很多重要的生命過程如基因表達、抵御逆境密切相關，因此越來越引起人們的關注。并且DNA甲基化的功能取決于靶基因的性質，DNA甲基化有助于調節基因表達、轉座子沉默、染色體相互作用和性狀遺傳。DNA甲基化主要發生在轉座因子（TEs）和重復序列并且往往沉默這些區域的表達，因此對基因組的穩定性有重要作用[2]。DNA甲基化也可能與基因調控有關，但在這種情況下，取決于DNA甲基化發生的區域。另一方面，特定區域的DNA甲基化也可以在有絲分裂或甚至減數分裂中穩定遺傳，起到“脅迫記憶”的作用，這些脅迫記憶與細胞程序性死亡、發育或應激反應有關，可以幫助植物抵御持續的脅迫[3]。

1 DNA甲基化的作用機制與基因表達調控

DNA甲基化是指甲基共價結合到DNA胞嘧啶（C）的第5位碳原子上。在大多數真核生物中，DNA胞嘧啶甲基化發生在CG區域，在植物中胞嘧啶甲基化也發生在CHG和CHH位點（H=A，C，or T）[4]。不同物種之間全基因組甲基化水平也有所不同，從模式植物擬南芥中5%到小麥大于20%。這種物種間的差異主要是由于重復序列的含量不同[5]。此外，在同一基因組中，胞嘧啶甲基化水平在不同的區域中也有顯著差異。例如，在擬南芥中，DNA甲基化發生在CG、CHG和CHH位點分別為24%、6.7%和1.7%[6]。在水稻中，CG甲基化發生在典型的基因區域，而TEs的CHG和CHH甲基化明顯富集[7]。在met1（擬南芥CG甲基化突變體）中，原本在野生型中高度甲基化的基因其表達量得到了明顯的增加[8]。CG基因甲基化發生在5端，包括啟動子和轉錄區的一部分，在3端，包括轉錄區域的一部分和3側翼序列，可能抑制基因表達。已經提出了兩個假說來解釋這種抑制作用：一方面，在啟動子和增強子區域的胞嘧啶甲基化可阻止轉錄因子（TF）的結合;另一方面，甲基化胞嘧啶可以招募甲基胞嘧啶結合蛋白，吸引了組蛋白去乙酰化酶和染色質重塑蛋白，壓縮了染色質從而無法轉錄[9]。在植物中基因本體也發生甲基化，但在這種情況下，DNA甲基化作用不太明顯。對基因本體甲基化的作用提出了三種不同的假說：它可以抑制編碼區內隱性啟動子的表達，它能提高初級轉錄本的正確剪接，或者它是轉錄沒有功能的副產物。

在擬南芥中大約三分之一的基因至少部分發生甲基化;此外，在不同的品種中TEs的DNA甲基化和DNA重復序列是非常相似的，不同生態型之間有50%的甲基化差異。對Vancouver和Columbia生態型的分析表明，10%的CG序列甲基化水平具有差異。甲基化多態性多見于上游或下游基因區，與基因表達水平呈負相關。另一方面，基因的甲基化多態性與基因表達的變化沒有明顯的相關性。相反，在楊樹中基因本體甲基化比啟動子甲基化對轉錄的抑制作用更強[10]。

DNA甲基化模式的動力學有三個過程：DNA從頭甲基化，維持甲基化和DNA脫甲基化。通過DNA復制過程中半保留機制，甲基化發生在對稱的CG和CHG位點上。相反，非對稱的CHH完全取決于從頭甲基化，發生在DNA復制周期后。在植物中，已經確定了有三種不同類別的甲基化轉移酶：即甲基轉移酶（METs），染色質甲基轉移（CMTs），和結構域重排DNA甲基轉移酶（DRMs）[11]。MET1（同源的哺乳動物蛋白）催化CG二核苷酸位點發生甲基化[12]。CMT3維持CHG位點的DNA甲基化，它是植物特異性DNA甲基化酶[13]。維持這兩種甲基化酶的運作需要激活染色質重塑因子DDM1的活性[14]。另一方面，CHH從頭甲基化主要是通過DRM1和DRM2，也有少部分需要CMT2參與。CHH序列中胞嘧啶殘基的甲基化經常與基因沉默聯系在一起[15]。植物DNA從頭甲基化的激活是由利用siRNA靶向DRMs并識別序列特異性位點[16]，從而介導DNA發生甲基化。

2 DNA甲基化的檢測方法

近年來，隨著分子遺傳學實驗技術的發展，一些表觀遺傳學檢測技術得到了發展和廣泛應用。特別是在DNA甲基化和組蛋白修飾的研究中，實驗方法得到了突飛猛進的發展。目前，DNA甲基化修飾的研究技術主要包括：

2.1 限制性內切酶檢測法（Southern Blot）

甲基化敏感限制性內切核酸酶（MSREs）是已經發現的320多種限制性內切核酸酶之一，用于鑒定特定序列是否被甲基修飾。這些酶大多數只能切割一個甲基化堿基位點，一些酶可以切割半甲基化（雙鏈中只有一條鏈被甲基化）位點，一些酶可以切割完全甲基化（雙鏈都被甲基化）位點。然而，5-羥甲基胞嘧啶、糖化5-羥甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或4-甲基胞嘧啶等卻因為它們的結構相似而難以識別。Southern Blot印跡法是最常用的基于此原理的方法[17]。CCGG序列經限制性內切酶HapⅡ和MspⅠ識別，DNA可分別被EcoRⅠ/HapⅡ，EcoRⅠ/MspⅠ酶切。本方法優點是：通過提供待測樣品的基因組DNA，無需了解整個DNA序列和詳細的一級結構，即可直接對甲基化進行評價和定量分析。

2.2 甲基化敏感擴增多態性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）分析法 ?MSAP以擴增片段長度多態性（AFLP）技術為基礎，用限制性內切酶Hpa II和Msp Ⅰ取代內切酶MseⅠ，用HpaⅡ和MspⅠ識別的5-CCGG序列取代MseⅠ特異性切割的片段。MSAP的實質是用甲基化特異性酶和序列5-CCGG取代AFLP技術中的功能酶和目標條帶。MSAP主要包括DNA模板制備、PCR擴增、雙酶切和電泳檢測。其原理是利用HapⅡ和MspⅠ酶對基因DNA進行雙酶切，然后加入與HapⅡ和MspⅠ相對應的限制性內切酶接頭，利用接頭序列設計引物特異性擴增5-CCGG位點的甲基化片段。HapⅡ和MspⅠ能識別同一位點，但甲基化敏感性不同。因此，擴增結果具有不同的條帶，可用于檢測基因組DNA的總甲基化水平，區分全甲基化和半甲基化狀態[18]。

2.3 亞硫酸氫鹽測序法

Frommer等[19]首次提出了亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing，BS）檢測5-mC。本方法的基本原理是先用亞硫酸氫鹽處理DNA，使未甲基化胞嘧啶C脫氨作用轉化為尿嘧啶U，然后設計引物通過PCR擴增目標片段，通過測序可區分5-mC和其他堿基，得到5-mC的位點信息。Bianchessi等[20]利用BS檢測血管內皮細胞線粒體DNA非編碼區甲基化狀態，發現5-mC不是隨機分布在DNA非編碼區，而是聚集在一起。該方法準確可靠，可檢測目標片段中各CpG位點的甲基化狀態。然而，該方法樣品制備過程復雜，需要大量的克隆和測序，成本較高。

2.4 高效液相色譜法

Kuo等[21]采用反相高效液相色譜法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）首次檢測了小牛胸腺和鮭魚精DNA中5-mC的含量。這提供了檢測整個基因組甲基化水平的典型方法。其主要過程為：利用脫氧核糖核酸酶（DNase1）、核酸酶P1（nuclease P1）和細菌的堿性磷酸酶水解DNA，水解產物經RP-HPLC分離得到5-甲基脫氧胞苷和其他脫氧核苷的峰，進一步計算基因組中5-mC的含量和5-mC與胞嘧啶的比例。Baumer[22]將變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）與PCR相結合，建立了基于異源雙鏈（錯配）DNA和同源雙鏈DNA不同解鏈特征的DHPLC-PCR方法，實現了DNA甲基化檢測的簡便、快速方法。隨后，隨著質譜技術的發展，高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）技術大大提高了5-mC檢測的特異性和靈敏度[23]。

3 DNA甲基化在植物應對逆境脅迫中的作用 ?盡管遺傳變異是植物通過長期適應和進化產生新基因的主要來源，但植物表觀遺傳變化更能使其快速地適應環境的改變。全基因組DNA甲基化圖譜在植物發育過程中會不斷發生改變，但環境因素也會影響甲基化多樣性[24]。許多研究一致認為，不同的環境脅迫，無論是非生物的還是生物的脅迫，都會引起基因組DNA甲基化的改變。甲基化模式的改變又反過來調控植物適應性響應。鹽脅迫能夠誘導麻瘋樹葉片和根系的DNA甲基化模式發生改變[25]，這些DNA甲基化的改變可能在耐鹽脅迫中發揮重要作用。冷脅迫能夠引起玉米幼苗基因組發生DNA去甲基化。DNA去甲基化主要參與轉座子激活、激素調節和光合作用等方面的調控。隨后，五個基因發生去甲基化并且其轉錄水平明顯增加，從而表明基因的去甲基化是一種快速響應冷脅迫的表觀遺傳[26]。體外培養的葡萄中DNA甲基化發生改變，當脅迫解除后，觀察到40%發生甲基化改變的位點恢復到之前狀態，因此作為一個可逆的脅迫適應機制，而60%發生DNA甲基化改變的位點仍維持著甲基化狀態，最有可能是繼承于有絲分裂[27]。

3.1 DNA甲基化模式與不同基因型抗逆性的關系

同一物種不同基因型的全基因組甲基化的改變與不同程度脅迫之間的聯系也經常被探究。許多研究表明植物DNA甲基化能夠響應鹽和干旱脅迫。例如，三種水稻對鹽和干旱的不同敏感性與它們之間存在幾個差異甲基化區域有關，其中許多甲基化區域與非生物脅迫應答基因的差異表達有關。研究表明，在干旱條件下，干旱敏感型水稻較耐旱型水稻具有更高甲基化水平[28]。在水稻抗旱品種dk151及其回交親本IR64中發現基因型特異性DNA甲基化模式。在脅迫恢復后，植株仍然保持著大約30%發生甲基化改變的位點，表明植物可能擁有一種記憶以往不利環境經歷的機制。在鹽脅迫下，耐鹽水稻（Pokkali）和鹽敏感水稻（IR29）中甲基化的可變性不同。在鹽脅迫條件下，耐鹽水稻比鹽敏感水稻的DNA甲基化改變能力強[29]。對兩個具有不同耐鹽性的小麥品種進行了研究，結果表明耐鹽小麥比的鹽敏感小麥的DNA甲基化水平高。鹽脅迫下，兩種品種中全基因組都發生了低甲基化。與之研究一致的是，在小麥耐鹽品種SR3和其祖先親本JN177有不同的DNA甲基化水平，鹽脅迫后兩個品種的DNA甲基化水平均降低。這些結果強調，DNA甲基化模式的變化可以被看作是植物對脅迫的普遍響應。此外，體細胞雜交誘導的甲基化改變可以增強SR3的耐鹽堿性[30]。

3.2 ?具有特異性的脅迫響應基因的DNA甲基化變化 ?大量研究表明，特定基因的DNA甲基化的動態變化直接參與不同脅迫應答的調控。以煙草和煙草花葉病毒之間發生的植物病原體相互作用為例，是由于DNA發生去甲基化激活防御基因。在感染期間，NtAlix1的低甲基化增強了這種病原體響應基因的表達量[31]。在同一植物–病原體相互作用中，可以抵制煙草花葉病毒侵染的N基因發生了CG低甲基化[32]。

已經報道過許多研究關于在非生物脅迫下，DNA甲基化水平和特定脅迫應答基因表達量的變化。煙草在不同的脅迫下，包括鋁、鹽、活性氧、低溫，會導致甘油磷酸二酯酶基因（NtGPDL）甲基化水平的變化。尤其是NtGPDL的GC位點在編碼區和啟動子發生去甲基化。因此，NtGPDL被誘導表達。這些結果表明在非生物脅迫下甲基化和NtGPDL表達量的關系[33]。與之研究結果一致的是，用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷處理水稻后，其氧化應激相關基因表達上調導致對鹽脅迫的耐受性增強[34]。同樣，在煙草中過表達擬南芥ROS1基因可以降低類黃酮和抗氧化途徑基因的啟動子區和編碼區的甲基化水平。由于提高了這些基因表達水平導致轉基因煙草具有更強的鹽脅迫耐受能力[35]。在玉米幼苗中，鹽脅迫使蛋白磷酸酶2C（zmPP2C）第一內含子和谷胱甘肽S-轉移酶（zmGST）發生甲基化改變。鹽脅迫誘導擬南芥zmPP2C內含子的高甲基化導致其表達量下降。另一方面，鹽脅迫誘導zmGST發生去甲基化從而使基因表達量升高[36]。在小麥中，鹽脅迫誘導了24個基因啟動子區和編碼區DNA甲基化發生改變，但只有啟動子區DNA甲基化的變化與基因表達的改變有關。在鹽脅迫下兩個發生甲基化和表達改變的基因，即TaFLSl基因編碼一種黃酮醇合成酶和TaWRSI5編碼一種蛋白酶抑制劑，能提高擬南芥的耐鹽性[30]。

在兩個具有不同抗旱性小麥品種中，鹽脅迫誘導胞漿中3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPC）的表達，它編碼一種在植物應激反應中起積極作用的蛋白質[37]。但抗性品種的轉錄水平高于易感品種。耐旱品種中鹽脅迫誘導GAPC基因啟動子區的CG和CHG位點發生去甲基化;另一方面，在對干旱敏感品種中鹽脅迫不影響CG區域甲基化狀態但提高了GAPC基因啟動子區CHG和CHH的甲基化水平。在脅迫響應過程中，兩個品種的小麥GAPC基因啟動子區發生了不同類型和不同水平的甲基化改變，說明應激反應中的啟動子甲基化和基因表達具有一定的關系[38]。番茄植株在干旱條件下，脫落酸-脅迫-成熟響應蛋白1（Abscisic Acid Stress Ripening1）的CHH位點發生低甲基化，同時誘導其表達量增加，從而增強了其適應環境能力[39]。脫落酸增強了浮萍的抗冷能力是通過改變甲基化狀態從而影響ATP酶基因的表達[40]。用亞硫酸氫鈉甲萘醌處理擬南芥植物，能夠激活擬南芥對生物和非生物脅迫的響應[41]，使脯氨酸代謝相關基因甲基化狀態發生改變。ERD5和P5CS1在CHG和CHH區域的甲基化改變，參與脯氨酸的生物合成和降解，誘導這兩個基因的表達升高并促進脯氨酸的積累，從而在抗逆性中發揮作用[42]。

在青蒿中，紫外光照射能夠誘導青蒿素生物合成途徑中的關鍵酶DBR2基因啟動子區4個CG，4個CHH和2個CHG位點發生去甲基化。分析顯示這個基因啟動子甲基化狀態的變化涉及七個轉錄因子結合位點，其中包括青蒿素生物合成的正調節WRKYs。總之，UV-B誘導DBR2基因的過表達從而使青蒿素積累。這些數據表明，在植物對UV-B輻射的響應中，DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳[43]。

參 考 文 獻

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（責任編輯：夏劍萍）